弱染色或無(wú)染色
來(lái)源
解決方案
脫蠟不充分 延長(zhǎng)切片脫蠟時(shí)間或更換新鮮二甲苯
無(wú)活性的一抗 更換新一批抗體
由于儲(chǔ)存不當(dāng)，抗體無(wú)法發(fā)揮作用 將抗體分裝成較小的體積并儲(chǔ)存在冰箱中（-20 至 -70°c），并避免重復(fù)凍融循環(huán)?；蚋鶕?jù)制造商的說(shuō)明儲(chǔ)存抗體。
抗體濃度太低 增加一抗和/或二抗的濃度?；蛘哌\(yùn)行連續(xù)稀釋測(cè)試以確定提供最佳信噪比的最佳稀釋度
抗體孵育時(shí)間不足 增加抗體孵育時(shí)間
組織固定不充分或不正確 增加后固定時(shí)間或嘗試不同的固定劑
組織過(guò)度固定 減少后固定的持續(xù)時(shí)間。如果組織已經(jīng)過(guò)度固定，請(qǐng)執(zhí)行適當(dāng)或推薦的抗原修復(fù)程序。
二抗和一抗不相容 使用可與一抗相互作用的二抗。例如，如果一抗是從兔子中產(chǎn)生的，則使用抗兔二抗
無(wú)活性二抗 更換新一批抗體
無(wú)活性 abc 試劑 更換新一批試劑
酶底物系統(tǒng)有缺陷或不相容 更換新一批試劑
底物孵育時(shí)間不足 增加底物孵育時(shí)間
封固劑不正確 選擇正確的封固劑
試劑使用順序錯(cuò)誤或步驟省略 檢查注釋或使用的程序
過(guò)度染色
來(lái)源
解決方案
一抗和/或二抗?jié)舛冗^(guò)高 降低抗體濃度或進(jìn)行滴定以確定一抗和二抗的最佳稀釋度
孵化時(shí)間太長(zhǎng) 減少孵化時(shí)間
孵化溫度太高 降低孵化溫度
底物孵育時(shí)間太長(zhǎng) 減少底物孵育時(shí)間
切片變干 避免切片變干
高背景
來(lái)源
解決方案
切片清洗不充分 步驟之間至少清洗 3 次
組織含有內(nèi)源性酶，例如過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶 在孵育一抗之前，使用甲醇或左旋咪唑溶液（阻斷 ap）中的 3% 過(guò)氧化氫（阻斷過(guò)氧化物酶）阻斷內(nèi)源酶活性。
組織含有內(nèi)源性生物素活性 在孵育一抗之前，使用親和素/生物素封閉試劑封閉內(nèi)源生物素活性。
一抗與組織非特異性結(jié)合或抗體濃度過(guò)高 使用較高稀釋度的一抗可以減少非特異性結(jié)合
二抗與組織的非特異性結(jié)合 用來(lái)自同一物種的正常血清作為二抗處理組織。
二抗與類(lèi)似物種的組織發(fā)生交叉反應(yīng)，即兔抗大鼠 igg 可能與小鼠組織發(fā)生交叉反應(yīng)。 使用預(yù)吸附的第二抗體，即在小鼠組織上使用兔抗大鼠igg，小鼠吸附，或在大鼠組織上使用兔抗小鼠igg，大鼠吸附。
由于固定不充分導(dǎo)致組織抗原擴(kuò)散 增加后固定時(shí)間
用于小鼠組織的小鼠抗體 一抗孵育前用 mouseonmouse 封閉試劑處理組織
切片變干
避免切片變干