近年來,elisa技術(shù)取得了顯著的發(fā)展,主要表現(xiàn)在以下方面:
1、繼單克隆抗體后的第三代抗體基因工程抗體的應(yīng)用,明顯地提高了檢測(cè)的特異性,基本消除了抗原、抗體間的非特異反應(yīng),保證了分析的準(zhǔn)確性。抗體制備技術(shù)的進(jìn)步,使試劑的生產(chǎn)制備得以規(guī)?;瑱z測(cè)范圍日益擴(kuò)展,小分子抗原、半抗原的檢測(cè)成為事實(shí)。
2、分析方式的改進(jìn)與多樣化提高了試驗(yàn)的敏感性。
(1)除早期的競(jìng)爭(zhēng)法,間接法外,又發(fā)展了雙抗原夾心法測(cè)抗體,偶聯(lián)酶標(biāo)記法測(cè)抗原,橋聯(lián)酶免疫分析,酶放大免疫分析技術(shù)等,后者應(yīng)用了親和素系統(tǒng),底物循環(huán)放大系統(tǒng),酶-抗酶放大系統(tǒng)及酶偶聯(lián)放大系統(tǒng)等。
(2)由于酶標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步,標(biāo)記酶的應(yīng)用已從過氧化物酶,擴(kuò)展到堿性磷酸酶,β半乳糖苷酶,尿素酶,葡萄糖6磷酸脫氫酶,葡萄糖氧化酶,蘋果酸脫氫酶,至今有二十多種酶被應(yīng)用于elisa ,但應(yīng)用比較多的仍然是辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,hrp)和堿性磷酸酶(alkalinephasphotase,alp)。
(3)改進(jìn)固相載體的技術(shù)
傳統(tǒng)elisa應(yīng)用的固相載體是聚苯乙稀微孔板,聚苯乙烯珠或條,后發(fā)展為硝酸纖維素膜、活化濾紙、硅片、尼龍、利用高分子材料合成的各種固相微粒等。為提高固相表面的結(jié)合容量,增加結(jié)合物的范圍而改造聚苯乙烯的表面,如用化學(xué)偶聯(lián)法導(dǎo)入功能性醛基、?;?、烷胺基等以更好地與蛋白質(zhì),多肽的羧基結(jié)合,用位點(diǎn)導(dǎo)向性共價(jià)偶聯(lián)法引入親和素,蛋白a,多聚賴氨酸等,以牢固地捕獲蛋白或多肽,超平整聚苯乙烯表面的制備,克服了表面粗糙帶來的不均一性,達(dá)到平均粗糙度只有2a+的超平整平面,實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白的結(jié)合容量大,脫附率低,孔間均一性好,使試驗(yàn)精密度達(dá)5%。
應(yīng)用于雙抗體夾心法時(shí),聚苯乙烯經(jīng)射線照射后,可以增加其吸附性能特別是對(duì)免疫球蛋白的吸附性能。近年美國(guó)corning公司研制成功表面經(jīng)琥珀酰亞胺酯活化酶標(biāo)板,其質(zhì)量達(dá)到氨基活化相似水平。