白藜蘆醇**醚脂質(zhì)體的制備及其質(zhì)量評(píng)價(jià)
摘 要：目的 制備白藜蘆醇**（btm）脂質(zhì)體，對(duì)其質(zhì)量特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并考察脂質(zhì)體對(duì)btm的增溶作用。方法 采用薄膜分散法制備btm脂質(zhì)體，以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化**工藝，微柱離心法測(cè)定其包封率，觀察其形態(tài)、粒徑及穩(wěn)定性，并考察其對(duì)btm的增溶作用。結(jié)果 優(yōu)化的*佳**工藝：**與磷脂質(zhì)量比為1∶20，*與磷脂比為1∶4，水化介質(zhì)為5%*；按該**制備的脂質(zhì)體包封率達(dá)（86.4±2.2）%；與游離btm相比，btm脂質(zhì)體在水中的溶解度增大了1 012多倍。結(jié)論 采用*佳**制備得到的btm脂質(zhì)體包封率較高，形態(tài)和粒徑較均勻，脂質(zhì)體可以較好地提高btm的溶解度。
關(guān)鍵詞：白藜蘆醇**；薄膜分散法；微柱離心法；包封率；正交設(shè)計(jì)
白藜蘆醇**（3, 5, 4′-trimethoxy-trans- stilbene，btm）是白藜蘆醇的全甲基化衍生物，具有明顯的抗新血管生成、抗有絲分裂作用，可以引起微管分解和微管蛋白解聚，用于抗腫瘤**。此外，btm具有抗過(guò)敏、保護(hù)胃粘膜損傷以及抗衰老作用[1-3]。但是btm難溶于水，光照下易發(fā)生異構(gòu)化并降解，使其應(yīng)用受到限制[4]。脂質(zhì)體可以增加難溶性的**的溶解性，提高光不穩(wěn)定性**的光穩(wěn)定性[5-6]。本實(shí)驗(yàn)將btm制備成脂質(zhì)體，對(duì)其**工藝和質(zhì)量特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并考察脂質(zhì)體對(duì)btm的增溶作用。
1 儀器與材料
lc20a—dad高效液相色譜儀（日本島津），n—1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械公司），digital sonifier s—450d超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（美國(guó)branson sonifier），nano—zs90激光散射粒徑儀（英國(guó)malvern公司），sirion 200場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（荷蘭fei公司）。btm對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%，中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院提供），btm樣品（中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院提供），*（s100，德國(guó)lipoid公司），*（天津博迪化工有限公司），葡聚糖凝膠g-50（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司），乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 btm脂質(zhì)體的制備
采用薄膜分散法[7-8]。精密稱取適量磷脂、*、btm于茄形瓶中，加入10 ml氯仿溶解后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，使形成均勻透明的薄膜，加入5%*溶液15 ml，45 ℃水浴下水化4 h，使薄膜溶脹充分水合*，得乳白色混懸液；探頭超聲2 min，0.45 μm微孔濾膜擠出，即得btm脂質(zhì)體。
2.2 btm定量測(cè)定方法的建立
2.2.1 色譜條件 色譜柱為hypersil ods2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（75∶25），柱溫30 ℃，體積流量1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)318 nm，進(jìn)樣量20 μl。
2.2.2 專屬性試驗(yàn) 分別取空白脂質(zhì)體、btm乙腈溶液、btm脂質(zhì)體各0.2 ml，甲醇破乳并稀釋*5 ml，按“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，在此色譜條件下，脂質(zhì)體輔料對(duì)btm定量測(cè)定無(wú)干擾。
2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取btm對(duì)照品10.0 mg于50 ml量瓶中，加乙腈溶解稀釋*刻度，得質(zhì)量濃度為200.0 μg/ml的btm儲(chǔ)備液。精密量取上述儲(chǔ)備液適量，乙腈稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.4、1.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/ml的系列溶液，按“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，以色譜峰峰面積（a）對(duì)質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程a＝134 298.1 c－588.8，r＝0.999 9，表明btm在0.1～32.0 μg/ml線性關(guān)系良好。
2.2.4 精密度試驗(yàn) 分別配制質(zhì)量濃度為1.0、8.0、32.0 μg/ml的btm乙腈溶液各5份，按“2.2.1”色譜條件測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度。日內(nèi)精密度rsd分別為0.27%、0.43%、0.19%，日間精密度rsd分別為1.46%、0.77%、0.65%。
2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取btm脂質(zhì)體混懸液適量，加甲醇稀釋*質(zhì)量濃度分別為1.0、8.0、16.0 μg/ml的供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件，在0、2、4、6、8、12 h分別測(cè)定btm的峰面積，計(jì)算其rsd分別為1.38%、1.06%、0.59%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取btm脂質(zhì)體混懸液適量，加甲醇稀釋*濃度分別為1.0、8.0、16.0 μg/ml的供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件，連續(xù)測(cè)定5次，其質(zhì)量濃度基本無(wú)變化，rsd分別為0.87%、0.23%、0.35%。
2.2.7 回收率試驗(yàn) 精密吸取0.2 ml空白脂質(zhì)體于5 ml量瓶中，分別加入25、200、400 μl質(zhì)量濃度為200.0 μg/ml的btm乙腈儲(chǔ)備液，加入甲醇破乳并稀釋*刻度，重復(fù)3次，得質(zhì)量濃度分別為1.0、8.0、16.0 μg/ml的樣品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。3種質(zhì)量濃度的回收率分別為101.3%、99.3%、99.6%，rsd分別為0.39%、1.53%、0.57%。
2.3 微柱離心法[9-11]測(cè)定btm脂質(zhì)體的包封率
2.3.1 微型凝膠柱的制備 稱取葡聚糖凝膠g-50 1.0 g于適量蒸餾水中，浸泡24 h，沸水浴煮沸20 min，使葡聚糖充分溶脹并除去氣泡。靜置冷卻后，裝填于2.5 ml注射器（底部填有適量脫脂棉）中，于離心機(jī)中3 000 r/min離心5 min，備用。
2.3.2 洗脫曲線的考察 精密吸取btm脂質(zhì)體混懸液0.2 ml，加于微柱的頂部，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；再于柱頂部加入0.2 ml蒸餾水，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；重復(fù)以上操作。從第12管開(kāi)始更換洗脫液，用乙醇-水（3∶2）混合溶劑代替蒸餾水作為洗脫液，操作同上，繼續(xù)收集10管洗脫液。所收集的洗脫液用甲醇破乳并稀釋定容*5 ml。按“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定a b c 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12t/ min **
btm質(zhì)量濃度，以洗脫管號(hào)為橫坐標(biāo)，btm質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2?？芍|(zhì)體在前8管基本洗脫*，btm游離**則在第13管以后被緩慢洗脫，可見(jiàn)葡聚糖g-50微型凝膠柱可較好地分離脂質(zhì)體與btm游離**。該方法可用于btm脂質(zhì)體包封率的測(cè)定。
2.3.3 包封率的測(cè)定 精密量取btm脂質(zhì)體混懸液0.2 ml于微柱中，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；再于柱頂部加入0.2 ml蒸餾水，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；重復(fù)以上操作。合并1～8管洗脫液，甲醇稀釋破乳后定容*5 ml，按“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定btm質(zhì)量濃度，記為c脂；另取btm脂質(zhì)體混懸液0.2 ml，加入甲醇超聲破乳，破乳后甲醇定容*5 ml，按“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定btm質(zhì)量濃度，記為c總，計(jì)算包封率。包封率＝c脂/ c總c脂為包封于脂質(zhì)體中的**質(zhì)量濃度，c總為脂質(zhì)體混懸液
中**的總質(zhì)量濃度
2.4 單因素考察
2.4.1 藥脂比對(duì)包封率的影響 固定*與磷脂的比為1∶3、水化介質(zhì)為5%*、水浴溫度45 ℃、水化時(shí)間4 h，選取btm與磷脂的質(zhì)量比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25制備脂質(zhì)體，測(cè)定包封率分別為46.5%、70.9%、73.6%、77.4%、77.6%。結(jié)果表明，藥脂比在1∶10以下時(shí)包封率可達(dá)70%以上。
2.4.2 膜材比對(duì)包封率的影響 固定藥脂比為1∶20、水化介質(zhì)為5%*、水浴溫度45 ℃、水化時(shí)間4 h，選取*與磷脂的比分別為1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶1制備脂質(zhì)體，測(cè)定包封率分別為68.8%、70.4%、80.2%、75.1%、38.6%。結(jié)果表明脂質(zhì)體的包封率隨著*嵌入量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。*對(duì)于脂質(zhì)體起著膜流動(dòng)性調(diào)節(jié)劑的作用，能適當(dāng)提高**包封率和穩(wěn)定性。但當(dāng)*的量過(guò)大時(shí)，與脂溶性**btm競(jìng)爭(zhēng)磷脂雙分子層位置，導(dǎo)致包封率下降。
2.4.3 水化介質(zhì)的種類對(duì)包封率的影響 固定*與磷脂的比為1∶3、藥脂比為1∶20、水浴溫度45 ℃、水化時(shí)間4 h，選取水化介質(zhì)分別為5%*、0.01 mol/l pbs、蒸餾水制備脂質(zhì)體，測(cè)定包封率分別為78.2%、69.4%、72.7%。結(jié)果表明，水化介質(zhì)為5%*時(shí)，脂質(zhì)體的包封率*佳。
2.5 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化**
在文獻(xiàn)資料[12]及單因素考察試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以包封率為指標(biāo)，選擇**與磷脂質(zhì)量比（a）、*與磷脂比（b）、水化介質(zhì)的種類（c）為考察因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，選用l9(34) 正交表安排試驗(yàn)，制備脂質(zhì)體，測(cè)定包封率。。由正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，影響脂質(zhì)體包封率的因素順序?yàn)閏＞a＞b，*佳**為a3b2c1，即**與磷脂比為1∶20，*與磷脂比為1∶4，水化介質(zhì)為5%*。
2.6 *佳**工藝的驗(yàn)證
按上述篩選得到的*佳**，制備3批btm脂質(zhì)體混懸液（約相當(dāng)于btm 0.33 mg/ml），測(cè)定包封率分別為88.7%、84.3%、86.2%。3次驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果基本一致，說(shuō)明所確定的優(yōu)化**合理可行，重現(xiàn)性良好。
2.7 btm脂質(zhì)體形態(tài)
取*佳**制備的btm脂質(zhì)體適量，用超純水稀釋100倍，以掃描電鏡觀察脂質(zhì)體形態(tài)?？梢?jiàn)脂質(zhì)體形態(tài)圓整，多為球形及類球形粒子，大小較均一。
2.8 粒徑和zeta電位的測(cè)定取*佳**制備的btm脂質(zhì)體適量，適當(dāng)稀釋后，用激光散射粒徑儀測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑和zeta電位。脂質(zhì)體的平均粒徑為（183.6±2.1）nm，pdi為0.265±0.006，zeta電位為（−15.3±1.2）mv。
2.9 初步穩(wěn)定性考察
取*佳**制備的btm脂質(zhì)體3批，置于（4±1）℃冰箱中，于3、5、10 d取樣，分別考察外觀、粒徑、zeta電位和包封率的變化。結(jié)果btm脂質(zhì)體在4 ℃條件下放置10 d后，外觀沒(méi)有發(fā)生明可以看出，低溫放置10 d，脂質(zhì)體的外觀、粒徑及zeta電位沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，包封率略有降低。
2.10 增溶作用
取過(guò)量的btm原料藥置于具塞試管中，加入超純水，渦旋使分散均勻，于（25±1）℃的恒溫振蕩器中48 h，平衡后取樣，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，按“2.2.1”下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得btm在純水中的飽和溶解度為0.32 μg/ml。取適量btm脂質(zhì)體于西林瓶中，加入10%蔗糖溶液作為凍干保護(hù)劑，冷凍干燥，得到凍干脂質(zhì)體。取過(guò)量?jī)龈煞塾诩兓?，振搖復(fù)溶使分散均勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，加入甲醇破乳后，按“2.2.1”下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得btm脂質(zhì)體中**的飽和溶解度為324.2 μg/ml。btm脂質(zhì)體較其原料藥在水中的飽和溶解度提高了1 012多倍，表明脂質(zhì)體對(duì)btm有較好的增溶作用。
3 討論
btm難溶于水，為脂溶性**。薄膜分散法簡(jiǎn)單易行，適合于脂溶性**脂質(zhì)體的制備。本實(shí)驗(yàn)采用該法制備btm脂質(zhì)體，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選*佳組成。制備過(guò)程中，成膜和水化是影響脂質(zhì)體包0.1 1 10 100 1 000 粒徑/ nm −200 −100 0 100 200zeta電位/ mv 封率與粒徑的關(guān)鍵步驟。成膜太厚、水化不*，制得的脂質(zhì)體粒徑偏大，放置易聚集，影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性；成膜不均勻，導(dǎo)致**未能很好地嵌入脂質(zhì)體雙分子層中，影響脂質(zhì)體的包封率。脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法通常有凝膠柱層析法、透析法、超速離心法、微柱離心法等[9-11,13]。凝膠柱層析法消耗時(shí)間長(zhǎng)，且不易控制洗脫液的體積流量；透析法消耗時(shí)間也較長(zhǎng)；超速離心法要求較高離心力才能將脂質(zhì)體和游離**分離。微柱離心法是一種快速、簡(jiǎn)便地分離脂質(zhì)體中游離**的方法，其優(yōu)點(diǎn)是脂質(zhì)體混懸液幾乎沒(méi)有被稀釋，可以避免脂質(zhì)體的滲漏。本實(shí)驗(yàn)采用微柱離心法測(cè)定btm脂質(zhì)體的包封率，脂質(zhì)體與游離**分離效果好，方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好。采用*佳**制備的3批脂質(zhì)體，包封率較高，粒徑分布均勻，重現(xiàn)性良好，并且可以顯著提高btm的溶解度。放置10 d后，外觀和粒徑均未發(fā)生明顯的變化，但包封率略有降低，推測(cè)**可能出現(xiàn)滲漏。將脂質(zhì)體凍干，可以顯著降低磷脂的水解和氧化速率，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[14]，實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步考察btm凍干脂質(zhì)體貯存穩(wěn)定性。
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