01破骨細(xì)胞及其作用
破骨細(xì)胞是一種高度分化的多核巨細(xì)胞，主要來源于單核/巨噬細(xì)胞造血干細(xì)胞系，是骨組織吸收的主要功能細(xì)胞，參與貫穿生命始終的骨重建過程。建立破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法有利于從細(xì)胞與分子水平進(jìn)行骨吸收機(jī)制的研究，也有利于骨質(zhì)疏松癥、骨硬化癥等代謝性骨病治療藥物的開發(fā)研究。因此，為了深入研究破骨細(xì)胞的形成機(jī)制并尋找其在疾病治療中的應(yīng)用，誘導(dǎo)分化破骨細(xì)胞成為了一個(gè)研究熱點(diǎn)。破骨細(xì)胞由血液及骨髓中的單核/巨噬細(xì)胞系分化而來，其分化過程經(jīng)歷破骨細(xì)胞前體（osteoclast precursor cells，opcs，或稱preosteoclasts）、融合的多核破骨細(xì)胞（non-functional polykaryons）、成熟破骨細(xì)胞（mature osteoclasts，也稱極化的多核破骨細(xì)胞）等幾個(gè)階段。骨骼是一種動(dòng)態(tài)組織，在結(jié)構(gòu)應(yīng)力和人體對(duì)鈣的需求等影響下，骨骼不斷被分解和重組。破骨細(xì)胞是骨骼持續(xù)破壞的介質(zhì)，在骨發(fā)育、生長(zhǎng)、修復(fù)、重建中具有重要的作用。
圖1.破骨細(xì)胞分化過程圖[1]
02破骨細(xì)胞標(biāo)志物破骨細(xì)胞占據(jù)骨頭表面的小凹陷，稱為howship腔隙；這種腔隙被認(rèn)為是由破骨細(xì)胞的酶對(duì)骨骼的侵蝕引起的。破骨細(xì)胞產(chǎn)生許多酶，其中主要是抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acidic phosphatase, trap），trap特異地分布于破骨細(xì)胞中，為破骨細(xì)胞所，通常作為鑒別破骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物。
03破骨細(xì)胞的獲得在破骨細(xì)胞分化成熟的過程中，rank /rankl/opg系統(tǒng)起著分化調(diào)控樞紐的作用，是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵信號(hào)途徑。核因子κb 受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κbligand，rankl）被認(rèn)為是促進(jìn)破骨細(xì)胞最為分化成熟及其功能活性最重要的因子，m-csf可誘導(dǎo)rank在破骨細(xì)胞前體的細(xì)胞膜上表達(dá)，進(jìn)而使表達(dá)rank的破骨前體細(xì)胞和rankl結(jié)合并產(chǎn)生效應(yīng)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。因此在體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中rankl和m-csf兩種細(xì)胞因子缺一不可?，F(xiàn)在破骨細(xì)胞主要采用的誘導(dǎo)法是骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法和raw264.7細(xì)胞系誘導(dǎo)法。
小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)
實(shí)驗(yàn)方案：
取6-17周齡小鼠，使用co2吸入或頸椎脫臼致死。用70%酒精消毒小鼠毛皮。
小心地取出股骨和脛骨，并將其放入10厘米的培養(yǎng)皿中。
無菌條件下準(zhǔn)備股骨和脛骨：
盡可能使用鑷子和剪刀去除所有皮膚、肌腱和肌肉。
用手術(shù)刀或剪刀切掉所有骨頭的兩端。
使用5ml注射器和23-g針頭在新鮮培養(yǎng)皿中用10ml破骨細(xì)胞培養(yǎng)基從所有骨頭中沖洗出骨髓。丟棄已沖洗的骨骼。
使用1ml注射器和27-g針頭，通過將細(xì)胞懸浮液吸入注射器和從注射器中抽出，盡可能分離細(xì)胞聚集體。然后，通過70µm細(xì)胞過濾器沖洗細(xì)胞懸液，并將其放入50 ml錐形離心管中。
用2ml培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞過濾器的尼龍網(wǎng)。
獲得的細(xì)胞懸液300×g，4°c下離心7min，棄上清。
用5ml紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞。冰上裂解10min。
離心，棄上清。再用5ml含10%fbs的 α-mem培養(yǎng)基重懸，離心，棄上清。
用5ml含m-csf (25 ng/ml）和10%fbs的 α-mem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每只小鼠一孔），置于37°c、5%co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜（14至18小時(shí)）。
第二天，吸取培養(yǎng)基，收集未粘附的細(xì)胞，注意勿刮擦平板底部。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至50ml錐形離心管中。300×g，4℃，離心7min，棄上清。
用5ml含10%fbs的 α-mem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并使用細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置計(jì)數(shù)活細(xì)胞。
以1×106cells/ml密度接種于培養(yǎng)板上，并加入m-csf（50ng/ml）和rankl（25–100 ng/ml）。
3天后更換培養(yǎng)基。第五天左右一般能觀察到多核成熟破骨細(xì)胞。
trap染色鑒定破骨細(xì)胞。
注意：
使用的rankl和m-csf濃度可能因小鼠和實(shí)驗(yàn)室條件而異。
從rankl和m-csf添加后的第4天起，每天至少觀察一次細(xì)胞，因?yàn)樾∈笃乒羌?xì)胞在分化后非常不穩(wěn)定。破骨細(xì)胞形成初期，細(xì)胞呈紡錘形，成熟后，細(xì)胞變大，多核，呈圓形。與人類破骨細(xì)胞相反，小鼠破骨細(xì)胞在成熟后24小時(shí)內(nèi)死亡。
由巨噬細(xì)胞系raw264.7誘導(dǎo)破骨細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)方案：
用含10%fbs的α-mem培養(yǎng)基將raw264.7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以3×104 cells/孔的密度接種于24孔板中。
細(xì)胞接種12h后，加入rankl（20-100ng/ml）。
每3天更換培養(yǎng)基，并同時(shí)補(bǔ)加rankl（20-100ng/ml）。
較為明顯的多核破骨細(xì)胞將在分化培養(yǎng)4天后開始出現(xiàn)，并在第5天至第6天逐漸變得豐富。
進(jìn)行trap染色，鑒定破骨細(xì)胞形成情況。
注意：
raw264.7細(xì)胞在含有10%fbs的rpmi-1640或deme培養(yǎng)基中可以增殖并保持其分化為破骨細(xì)胞的能力，而其在含有10%fbs的α-mem中培養(yǎng)可進(jìn)行破骨細(xì)胞分化試驗(yàn)。
raw 264.7細(xì)胞表達(dá)m-csf及其受體c-fms。因此，僅加入rankl就足以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，無需額外加入m-csf。
（*以上方案供參考，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況具體優(yōu)化）
04產(chǎn)品特點(diǎn)破骨細(xì)胞能否誘導(dǎo)成功影響因素眾多，其中調(diào)節(jié)信號(hào)通路的關(guān)鍵細(xì)胞因子至關(guān)重要。翌圣生物提供高活性hiacti™細(xì)胞因子rankl和m-csf，高純度、高質(zhì)量，助力破骨細(xì)胞培養(yǎng)。
數(shù)據(jù)展示
高純度（>95%）
高活性(cell based assay）
05相關(guān)產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱
貨號(hào)
規(guī)格
mouse rankl
90630es08
5 μg
mouse m-csf
91114es10
10 μg
human rankl
90629es50
50 μg
human m-csf
91103es10
10 μg
參考文獻(xiàn)
[1]william j. boyle*, w. scott simonet? & david l. lacey.osteoclast differentiation and activation.nature, 423, pages337–342 (2003).