在光學(xué)顯微鏡下，當(dāng)來自照明源的光通過聚光，然后通過樣品，一些光通過這兩個(gè)周圍，并通過在其路徑不受干擾試樣。 該光稱為直接 ，undeviated 或非衍射光，和表示背景光。 一些光與樣品相互作用的偏離或衍射。 衍射光呈現(xiàn)半波長或180度的相位與已經(jīng)沒有遇到障礙物穿過直射光。 二分之一波長的相位差，所引起的試樣本身，使該光以引起與直接光消干涉時(shí)都在位于目鏡的固定光闌的中間像平面到達(dá)。 目鏡的眼透鏡進(jìn)一步放大這個(gè)圖像，終投射到視網(wǎng)膜上，照相機(jī)的膠片平面，或光敏感的數(shù)字圖像傳感器的表面上。
現(xiàn)在的情況是，直接或undeviated光由物鏡投影并在目鏡的膜片在整個(gè)圖象平面中均勻分布。 由檢體衍射的光發(fā)生干涉在物鏡后焦平面(見圖1)和被帶入焦點(diǎn)以各種局部地方相同的圖像平面上，其中，所述衍射光產(chǎn)生破壞性干擾，并降低強(qiáng)度，造成一個(gè)產(chǎn)生上含灰度值從非常暗到非常亮的廣泛模式。 亮和暗的這些模式是我們承認(rèn)作為標(biāo)本的圖像。 因?yàn)槲覀兊难劬υ诹炼茸兓舾校瑘D像變得原始試樣的或多或少忠實(shí)重建。
為了幫助理解成像的基本原理，建議讀者嘗試以下的運(yùn)動，并使用公知的周期性結(jié)構(gòu)的對象作為樣品。 這些實(shí)驗(yàn)是容易使用的一個(gè)階段微米或密集的暗線類似光柵進(jìn)行。 要繼續(xù)，將精細(xì)刻劃光柵顯微鏡舞臺上，并使用10倍，然后40倍的物鏡，使其焦點(diǎn)。 卸下目鏡，并且在它的位置，插入一個(gè)相位望遠(yuǎn)鏡這樣可以觀察到物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面。 如果聚光鏡孔徑光闌閉合大多數(shù)的方式，光的明亮的白色*點(diǎn)會出現(xiàn)在物鏡，這是孔徑光闌的圖像的后部。 向右側(cè)和左側(cè)的*點(diǎn)的，一系列衍射譜(也孔徑光闌的圖像;在圖1中呈現(xiàn))的將存在，每個(gè)彩色藍(lán)色到*點(diǎn)的部分，而位于該部分紅色從*亮點(diǎn)頻譜遠(yuǎn)(如示于圖2)。 這些有色光譜的強(qiáng)度根據(jù)多遠(yuǎn)頻譜從*點(diǎn)位于減小。
落在物鏡的外周附近的那些衍射譜比更靠近*點(diǎn)的調(diào)光器。 在圖2所示的衍射光譜使用三種不同的物鏡放大率捕獲。 在圖2(b)中，在10倍的物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面可見的衍射圖案包含兩個(gè)衍射光譜。 如果光柵被從階段除去，如在圖2(a)所示，這些光譜消失，僅孔徑光闌的中心圖像保持。 如果光柵被重新插入，光譜再次出現(xiàn)。 需要注意的是彩色光譜之間的空間顯得較暗。 如果光柵與10x物鏡觀察可以觀察到只有一對光譜。 在這種情況下，一個(gè)衍射斑點(diǎn)出現(xiàn)在左邊，一個(gè)出現(xiàn)在中心孔開口的右側(cè)。 如果行光柵是用40×物鏡檢查(如圖2的(c))，幾衍射光譜出現(xiàn)在中心孔的左側(cè)和右側(cè)。 當(dāng)倍率增加到60倍或63×(并假設(shè)它具有較高的數(shù)值孔徑比40x物鏡)，幾個(gè)另外的光譜(參見圖2(d))的出現(xiàn)，以左，右的那些與40x物鏡可見的到位。
因?yàn)楫?dāng)光柵除去有色光譜消失，則可以假定這是通過影響光通過，由此產(chǎn)生的著色光譜檢體本身。 此外，如果孔徑光闌關(guān)閉到一個(gè)非常小的開口尺寸，我們將看到，更高的數(shù)值孔徑的物鏡掌握多種這些有色光譜的比做低數(shù)值孔徑的物鏡。 這兩個(gè)概念對理解圖像形成的重要性將成為隨后的段落清晰。 光的中心光點(diǎn)(聚光鏡孔徑光闌的圖像)表示直接或undeviated光穿過樣品或原狀的樣品周圍(在圖3(b)所示)。 這就是所謂的第0或零級。 上零級的各側(cè)的孔徑光闌的較暗圖像被稱為，第二，第三，第四，等等分別訂單，如由模擬衍射圖案如圖3(a)表示，這將在被觀察40倍的物鏡后焦平面。 所有捕獲命令表示，在這種情況下，線光柵作為在物鏡的后焦平面可見的衍射圖案。
孔徑光闌的微弱衍射圖像是由衍射波前引起的，在扇形散開，在各線光柵的開口(如圖3(b))。 藍(lán)色波長比綠色波長，這是在比紅的波長更小的角度衍射的更小的角度衍射。 在物鏡的后焦平面，從每個(gè)狹縫藍(lán)色波長干涉建設(shè)性地產(chǎn)生每個(gè)光譜或命令的衍射圖像的藍(lán)色區(qū)域。 紅色和綠色的區(qū)域(圖3的(a))被隔開的位進(jìn)一步，但是從同樣的現(xiàn)象發(fā)生。 其中，衍射波長的一半波為每個(gè)這些顏色步驟的，海浪消干涉，以產(chǎn)生光譜或命令之間的暗區(qū)。 在零階的位置，從每個(gè)狹縫所有波長建設(shè)性添加。 這產(chǎn)生你看到的第零級的明亮的白色光(參見圖2，3和4)在物鏡的后焦平面的中心。
行的更接近的間隔光柵，光譜越少，將通過給定的物鏡被捕獲，如在圖4(交流)示出。 在圖4所示的衍射圖(一)用40x物鏡成像的下部的線在如圖4(b)，其中所述狹縫靠得更近光柵捕獲。 在圖4(c)中，物鏡聚焦于線光柵的上部(圖4的(b))，其中狹縫是相隔較遠(yuǎn)，并且更光譜由物鏡捕獲。 的直接光，并從更高階的衍射大值的光被物鏡聚焦在目鏡的固定光闌，以在中間像平面的圖像。 這里的直接和衍射的光線干涉，并從而重建成由所述目鏡的眼透鏡看到和進(jìn)一步放大了真實(shí)，倒象。 這在圖4(d)通過圖4(g)與兩種類型的衍射光柵的說明。 在圖4(d)所示的正方形網(wǎng)格代表網(wǎng)格的無畸變圖象(實(shí)際上，通常的檢體圖像通過目鏡觀察到的)通過物鏡的全孔徑看到。 從該網(wǎng)格導(dǎo)出的衍射圖案被示為將在物鏡的后焦平面(圖4(e))的可見一個(gè)錐光圖像。 同樣地，一六角形排列格子的無畸變圖象(圖4(f))的產(chǎn)生的一階衍射圖案的相應(yīng)六角形排列錐光圖像(圖4(g))。
衍射光及解決
顯微鏡標(biāo)本可以被認(rèn)為是與細(xì)節(jié)和開口跨越大范圍的尺寸的復(fù)雜的線或圖案的光柵。 成像的概念在很大程度上是由阿貝，19世紀(jì)德國著名的顯微鏡和光學(xué)理論家發(fā)展。 根據(jù)阿貝(他的理論仍然被廣泛地在目前的時(shí)間接受)，如果物鏡捕捉2個(gè)數(shù)量的光的，諸如光衍射的1階和至少第0級的檢體的細(xì)節(jié)將得到解決。 衍射級是獲準(zhǔn)進(jìn)入物鏡的數(shù)量越多，越準(zhǔn)確的圖像將代表原始對象。 此外，如果折射率高于空氣(如浸油)的介質(zhì)中的空間中使用的物鏡的前透鏡和蓋玻片頂部之間(如所示用于干物鏡在圖5(a))的的衍射級的角度被減小，衍射光的風(fēng)扇將被壓縮。 其結(jié)果是，一個(gè)油浸物鏡可以捕獲更多衍射級和比干物鏡(圖5(b))的產(chǎn)生更好的分辨率。 比較所捕獲的訂單在圖5(a)和5(b)中。 此外，由于藍(lán)色光以比綠色光或紅色光的較小角度衍射，給定孔徑的透鏡可以捕捉的光的更多的訂單時(shí)，波長在可見光譜的藍(lán)色區(qū)域。 這兩個(gè)原則解釋經(jīng)典的瑞利方程經(jīng)常被引用作為計(jì)算在顯微鏡點(diǎn)至點(diǎn)分辨率的基礎(chǔ)：
d(分辨率)= 1.22•(λ/ 2na)(1)
其中，d是兩個(gè)相鄰的顆粒(還允許顆粒被感知為獨(dú)立的)之間的空間中，λ是照明的波長，na是物鏡的數(shù)值孔徑。 假定在顯微鏡還裝有具有相同的數(shù)值孔徑的物鏡的聚光鏡(沒有聚光鏡，分辨率將是一半好導(dǎo)致分辨細(xì)節(jié)的兩倍大)。 允許進(jìn)入物鏡更高衍射級的數(shù)量越多，可被清楚地分離或拆分試件的細(xì)節(jié)越小。 此處是采用高數(shù)值孔徑物鏡用于檢查在各個(gè)試樣的小可能的信息的值。 同樣地，可見光的使用的波長越短，分辨率越高。 這些想法解釋為什么高數(shù)值孔徑，復(fù)消色差透鏡可以單獨(dú)在藍(lán)光極小的細(xì)節(jié)。 在物鏡塊的外衍射級的后面放置一個(gè)遮光掩膜。 這會減小光柵線的分辨率，或任何其他檢體的細(xì)節(jié)，或它*破壞了分辨率，以使試樣不可見。 因此，通常小心不要關(guān)閉下面物鏡的孔徑的建議的三分之二聚光鏡孔徑光闌。
物鏡的故障把握在未解決的圖像的衍射級的結(jié)果的一個(gè)以上。 在具有非常微小的細(xì)節(jié)的檢體中，衍射風(fēng)扇以一個(gè)非常大的角度傳播，需要高數(shù)值孔徑物鏡捕獲它們。 同樣，由于衍射球迷在浸油或水的壓縮，專為這種用途物鏡可以給比干物鏡更高的分辨率。 如果備用衍射級不被改變(仍假定光柵作為我們的樣品)，在光柵的行數(shù)會出現(xiàn)加倍(寄生分辨率)。 重要的警告是在物鏡的介紹后實(shí)際行動產(chǎn)生確定的終圖像。 在檢體的小細(xì)節(jié)(相對于線光柵)，物鏡的直接和衍射光投射到目鏡光闌的像平面中的稱作艾里斑小的，圓的衍射圖案的形式(在圖6所示) 。 高數(shù)值孔徑物鏡捕獲更多的衍射級的生產(chǎn)更小尺寸磁盤將比低數(shù)值孔徑的物鏡。 在圖6中，示出艾里斑大小從圖6(a)至圖6的(c)穩(wěn)定下降。 在圖6中的較大磁盤大小(a)和(b)中通過以較低的數(shù)值孔徑物鏡產(chǎn)生的，而在圖6(c)該非常尖銳艾里斑是由非常高的數(shù)值孔徑的一個(gè)目的產(chǎn)生的。
在目鏡膜片水平所產(chǎn)生的圖像實(shí)際上是被認(rèn)為是樣品的亮和暗區(qū)域艾里磁盤的鑲嵌。 如果兩盤非常接近，他們的核心亮點(diǎn)交叉重疊，這些重疊的圓盤所代表的兩個(gè)細(xì)節(jié)都沒有解決或分離，從而表現(xiàn)為一個(gè)(如圖6所示(e))。 與此相反，在圖6(d)所示的艾里斑只是足夠遠(yuǎn)，以得到解決。 要記住的基本原理是，直接和衍射光(或直接或衍射光的操縱)的組合是在圖像形成至關(guān)重要。 對于這種操縱的關(guān)鍵位置是物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面和聚光鏡的前焦平面。 這個(gè)原則就是從根本上大部分的光學(xué)顯微鏡對比改進(jìn)方法。 更重要的是，它是在高放大倍率特別重要的小細(xì)節(jié)關(guān)閉大小的光的波長。 阿貝在開發(fā)這些概念來解釋的光吸收或幅度標(biāo)本成像的。