體細胞胚胎發(fā)生（somatic embryogenesis,se）可以不經(jīng)過配子融合，由體細胞分化發(fā)育成整個植株。se是一個多因素的發(fā)育過程，也是研究細胞全能性的理想模型。目前，se在多個領(lǐng)域得到了應(yīng)用，例如：種質(zhì)保護、人工種子生產(chǎn)、單倍體育種、無性繁殖，以及作為植物生物技術(shù)研究領(lǐng)域的平臺工具。然而，目前對se調(diào)控機制的理解僅限于少數(shù)模式植物（例如：擬南芥），而且不同物種之間se調(diào)控機制存在很大差異。因此，深入研究重要經(jīng)濟作物棉花的se調(diào)控機制對棉花育種和繁殖具有重要的意義。
2023年7月11日，鄭州大學(xué)與中棉所棉花生物學(xué)國家重點實驗室的研究成果發(fā)表在new phytologist（if=9.4，q1區(qū)）期刊上，題目為“ghrcd1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the ghmyc3-ghmyb44-ghlbd18 transcriptional cascade”。該研究使用dna親和純化測序(dap-seq)技術(shù)鑒定了陸地棉ghmyc3的結(jié)合基序和靶基因。揭示了ghrcd1-ghmyc3-ghmyb44-ghlbd18轉(zhuǎn)錄級聯(lián)調(diào)控棉花se的分子機制，為細胞全能性以及棉花基因工程研究提供了新思路。
1.ghmyc3是棉花se過程中一個重要的調(diào)控因子
通過序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，在陸地棉中篩選到一個與homo-myc具有高度系統(tǒng)發(fā)育相似性的同源基因ghmyc3，具有1個bhlh和1個bhlh-myc_n結(jié)構(gòu)域。于是假設(shè)ghmyc3在決定細胞命運方面具有與人類myc相似的生理功能。
為研究ghmyc3對se過程中細胞命運轉(zhuǎn)變的影響，構(gòu)建了過表達ghmyc3的棉花轉(zhuǎn)基因系（oe-ghmyc3）。表型分析發(fā)現(xiàn)過表達ghmyc3顯著誘導(dǎo)了se，促進愈傷組織生長。隨后，ghmyc3的rnai細胞系（ri-myc3）表型分析發(fā)現(xiàn)ri-ghmyc3與wt的愈傷組織形成率一致，但新鮮愈傷組織的重量（fw）略輕，胚性愈傷組織（ec）分化率顯著降低。以上結(jié)果表明，ghmyc3促進棉花體細胞向愈傷組織的去分化，但阻止了向ec的轉(zhuǎn)變過程。
ghmyc3調(diào)控棉花se過程
(a)智人、陸地棉、擬南芥中myc蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析。(b)棉花se過程示意圖。下胚軸作為外植體，用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，體細胞去分化形成愈傷組織，在60-90天的生長過程中，增殖的愈傷組織重新分化為ec，ec發(fā)育成體細胞胚，而后在體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)為幼苗。(c) wt、oe-ghmyc3、ri-ghmyc3在ec分化過程中的形態(tài)差異。(d)長日照下生長的wt、oe-ghmyc3、ri-ghmyc3植株葉片組織中g(shù)hmyc3的相對表達量。(e) wt、oe-ghmyc3、ri-ghmyc3愈傷組織的fw。(f) wt、oe-ghmyc3、ri-ghmyc3的ec分化率。
2.ghmyc3直接與ghmyb44和ghlbd18的啟動子結(jié)合，調(diào)控其表達
dap-seq分析鑒定了ghmyc3的dna結(jié)合基序及其下游靶基因。鑒于愈傷組織形成和根系生長具有共同的調(diào)控途徑，作者鑒定到了與根系發(fā)育和生長素信號通路有關(guān)的2個靶基因ghmyb44和ghlbd18。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)ghmyc3、ghmyb44和ghlbd18主要表達于細胞核。在ghmyb44和ghlbd18的啟動子中存在與ghmyc3結(jié)合的g-box（cacgtt）元件。酵母單雜交（y1h）和電泳遷移率（emsa）實驗驗證了ghmyc3特異性地結(jié)合ghmyb44和ghlbd18啟動子中的g-box基序。另外，煙草葉片瞬時表達分析發(fā)現(xiàn)ghmyc3以g-box依賴的方式激活ghlbd18的轉(zhuǎn)錄，抑制ghmyb44的轉(zhuǎn)錄。
ghmyc3直接結(jié)合并調(diào)控ghmyb44和ghlbd18的轉(zhuǎn)錄
(a) ghmyc3的結(jié)合序列在基因組上的分布。(b) ghmyc3的主要結(jié)合基序ca t/c gt t/g。(c) ghmyc3下游基因的go富集分析。(d)ghmyb44和ghlbd18啟動子序列中包含g-box基序。(e) y1h實驗。(f) emsa實驗。(g-h)煙草葉片瞬時表達分析及l(fā)uc熒光強度統(tǒng)計。
3.ghmyb44與ghlbd18的啟動子直接相互作用，抑制其表達
dap-seq分析發(fā)現(xiàn)在ghlbd18啟動子中存在myb轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。y1h和emsa實驗驗證了ghmyb44與ghlbd18啟動子的直接結(jié)合。瞬時基因表達分析表明ghmyb44通過直接結(jié)合ghlbd18的啟動子序列抑制其表達。以上結(jié)果表明，ghmyc3除了通過與ghlbd18啟動子特定位點結(jié)合直接激活ghlbd18的表達外，還通過ghmyb44-ghlbd18轉(zhuǎn)錄級聯(lián)信號間接調(diào)控ghlbd18的表達。
4.ghmyb44通過ghlbd18調(diào)控se過程
利用oe-ghmyb44、srdx-ghmyb44（特異性沉默系）和oeghlbd18棉花株系進一步研究myb44調(diào)控se的過程。與wt相比，在oe-ghmyb44中愈傷組織起始延緩，愈傷組織增殖減弱，ec分化加速；相反，在srdx-ghmyb44和oe-ghlbd18中愈傷組織起始提前，愈傷組織增殖增強，ec分化延遲。因此，ghmyb44在ghlbd18的上游發(fā)揮作用，在愈傷組織起始、愈傷細胞增殖和愈傷組織向ec的轉(zhuǎn)變過程中控制細胞命運的決定。
5.ghrcd1與ghmyc3相互作用調(diào)節(jié)se過程
采用酵母雙雜交（y2h）鑒定到在se過程中與ghmyc3互作的蛋白ghrcd1，該蛋白在愈傷組織和ec形成的不同階段均被誘導(dǎo)，但在體細胞胚中保持較低水平。雙分子熒光互補（bifc）實驗、pull down實驗、luc互補實驗證明了ghmyc3與ghrcd1蛋白有相互作用。ghrcd1的敲除突變體（ko-ghrcd1）和過表達轉(zhuǎn)基因系（oe-ghrcd1）實驗分析發(fā)現(xiàn)，與wt相比ko-ghrcd1表現(xiàn)出愈傷組織起始提早，生長加快，fw增加；而與wt和ko-ghrcd1相比，oe-ghrcd1表現(xiàn)為愈傷組織起始延遲，增殖減少，ec分化率降低。結(jié)果表明，rcd1的適當(dāng)表達對se過程至關(guān)重要，但rcd1的過表達或突變均不利于愈傷組織細胞的命運轉(zhuǎn)變過程。
ghrcd1與ghmyc3有相互作用
(a)y2h實驗。(b) bifc實驗。(c) pull down實驗。(d) luc互補實驗。(e-g)ko-ghrcd1和oe-ghrcd1在se不同發(fā)育階段的形態(tài)學(xué)分析(e)、fw分析(f)和ec分化率分析(g)。
6.ghrcd1拮抗ghmyc3調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄能力
使用雙熒光素酶報告（dual-luc）實驗檢測ghrcd1是否影響ghmyc3對其下游靶點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。將luc報告基因分別與ghmyb44和ghlbd18啟動子融合，再通過瞬時轉(zhuǎn)染測定啟動子活性。ghmyc3的過表達抑制了ghmyb44啟動子驅(qū)動的luc表達，但過表達ghrcd1削弱了這種抑制作用；ghmyc3增強了ghlbd18啟動子驅(qū)動的luc表達，而過表達ghrcd1削弱了這種增強作用。此外，ghmyb44能夠直接抑制ghlbd18的表達，但ghmyb44和ghmyc3共表達導(dǎo)致ghlbd18啟動子驅(qū)動的luc表達水平顯著高于單獨表達ghmyb44，這表明ghmyc3直接干擾了ghmyb44對ghlbd18的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。qrt-pcr檢測結(jié)果表明ghmyb44的表達水平與ghmyc3的表達呈負相關(guān)。ghlbd18在oe-ghmyc3和srdx-ghmyb44中表達上調(diào)，而在ri-ghmyc3細胞系中表達下調(diào)。總之，在se過程中g(shù)hrcd1抑制ghmyc3對ghmyb44和ghlbd18的表達調(diào)控能力。
7.由rcd1-myc3-myb44-lbd18級聯(lián)介導(dǎo)的活性氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)細胞命運轉(zhuǎn)變
利用ros熒光探針h2dcf和bcip-nbt檢測se不同發(fā)育階段的ros積累，發(fā)現(xiàn)ros最初在外植體階段的損傷組織中增加，細胞內(nèi)ros水平與愈傷組織細胞增殖呈正相關(guān)，第21 d時在發(fā)育的愈傷組織中觀察到氧化爆發(fā)。在ec發(fā)育過程中，ros在愈傷組織的胚性前區(qū)富集，但在其他部位枯竭。過表達ghmyc3和ghlbd18導(dǎo)致ros積累，促進愈傷組織細胞增殖，然而過表達ghmyb44則相反。最后，該研究提出了一個愈傷組織形成和se的模型。在下胚軸外植體培養(yǎng)的不同發(fā)育階段，ghrcd1、ghmyc3、ghmyb44和ghlbd18的表達水平與細胞命運決定和細胞分化動態(tài)緊密相關(guān)。這些基因的精確時空表達可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ros的積累，進而影響se過程中的細胞命運轉(zhuǎn)變。
ghrcd1-ghmyc3-ghmyb44-ghlbd18信號級聯(lián)調(diào)控se的機制模型圖
在愈傷組織誘導(dǎo)過程中，ghmyc3通過調(diào)控ghmyb44和ghlbd18的轉(zhuǎn)錄，進一步激活ros依賴的信號通路，使ros優(yōu)先在誘導(dǎo)部位積累，并在愈傷組織增殖過程中達到峰值。在ec獲得過程中，較高水平的ghrcd1可能抑制ghmyc3對ghmyb44和ghlbd18的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而相應(yīng)地減少ros的積累，而且ros在ec周圍呈極性分布。
本文小結(jié)：該研究揭示了se過程中細胞命運轉(zhuǎn)變的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。ghmyc3通過結(jié)合ghmyb44和ghlbd18啟動子中的g-box元件調(diào)節(jié)其表達。ghrcd1拮抗ghmyc3對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。ghrcd1-ghmyc3-ghmyb44-ghlbd18組成的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)模塊呈現(xiàn)時序表達模式，并時序性的調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ros穩(wěn)態(tài)，進而影響se過程中細胞的命運。
參考文獻：yuan j, liu x, zhao h, wang y, wei x, wang p, zhan j, liu l, li f, ge x. ghrcd1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the ghmyc3-ghmyb44-ghlbd18 transcriptional cascade. new phytol. 2023. doi: 10.1111/nph.19120.(if=10.323)
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