crispr/cas9 基因編輯技術(shù)需要通過下一代測(cè)序 (ngs) 來驗(yàn)證，能夠在核苷酸水平分辨率下進(jìn)行大規(guī)模評(píng)估基因編輯的準(zhǔn)確性和可靠性。高效、可自動(dòng)化和可擴(kuò)展的 circle-seq 是一種體外 ngs 測(cè)定，可以對(duì) crispr 介導(dǎo)的切割進(jìn)行靈敏的脫靶檢測(cè)。crispr/cas9 基因編輯技術(shù)crispr 代表成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列。這些重復(fù)的 dna 片段最初來源于病毒病原體，并作為模板將 crispr 相關(guān)蛋白 9 (cas9) 核酸內(nèi)切酶引導(dǎo)至新入侵的病毒。當(dāng) cas9 遇到同源病毒序列時(shí)，它會(huì)產(chǎn)生近端雙鏈斷裂 (dsb)。類似地，當(dāng) cas9 和指導(dǎo) rna (grna) 被轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，接近 grna 的同源序列被切割。然后通過內(nèi)源性易出錯(cuò)的非同源末端連接 (nhej) 過程將末端重新連接在一起，或使用外源提供的供體（修復(fù)）模板通過同源定向修復(fù) (hdr) 進(jìn)行修補(bǔ)，從而修復(fù) dsb。研究人員使用 hdr 以已知且可預(yù)測(cè)的方式改變基因序列。grna 決定編輯將在何處進(jìn)行，而供體模板 dna（其末端與 dsb 站點(diǎn)共享同源性）決定編輯的外觀。由于這些是關(guān)鍵組件，因此確保 grna 和修復(fù)模板沒有錯(cuò)誤非常重要。使用kapa hifi高保真dna聚合酶等優(yōu)質(zhì)試劑進(jìn)行擴(kuò)增有助于確保準(zhǔn)確性和特異性。ngs驗(yàn)證法即使使用的聚合酶為 crispr hdr 生成準(zhǔn)確的修復(fù)模板，實(shí)驗(yàn)室也需要一種方法來驗(yàn)證基因編輯是否成功——編輯的位點(diǎn)包含預(yù)期的序列。ngs 提供了一種高通量、自動(dòng)化友好的方法來驗(yàn)證克隆分離物中的目標(biāo)基因編輯。為了從 ngs 中獲得好的結(jié)果，強(qiáng)大的文庫制備是少不了的。dana-farber 癌癥研究所的分子生物學(xué)核心設(shè)施 (mbcf) 發(fā)現(xiàn) kapa hyperprep 試劑盒提供的工作流程能夠適應(yīng)各種擴(kuò)增子輸入量和大小，從而最大限度地減少輸入 qc 和特定樣本工作流程修改的需要. 使工作流程適應(yīng)他們的自動(dòng)液體處理系統(tǒng)，允許在大約 3-1/2 小時(shí)的儀器時(shí)間內(nèi)基于擴(kuò)增子的文庫制備 96 個(gè)克隆樣本。crispr的切割位點(diǎn)的優(yōu)化驗(yàn)證預(yù)期的位點(diǎn)是否已成功修改是一回事，但無論計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)多么強(qiáng)，基于 crispr/cas9 的基因編輯中使用的 cas9 核酸酶都有可能以類似的方式切割和改變非預(yù)期的目標(biāo)序列。因此，實(shí)驗(yàn)室需要一種方法來識(shí)別可能的脫靶切割位點(diǎn)，并能夠?qū)⑦@些位點(diǎn)與擴(kuò)增導(dǎo)致的簡(jiǎn)單錯(cuò)誤區(qū)分開來。有幾種 ngs 工作流程可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。例如，digenome-seq 是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的體外檢測(cè)方法，其中使用 cas9 核酸酶切割從目標(biāo)細(xì)胞中提取的基因組 dna，將 ngs 測(cè)序接頭連接到所有游離端，并對(duì)生成的文庫進(jìn)行測(cè)序以鑒定削減。然而，由于文庫沒有針對(duì)切割位點(diǎn)進(jìn)行富集，因此未修飾 dna 的背景很高，需要大量的測(cè)序讀數(shù)，并且很難找到罕見的切割事件。crispr/cas9基因編輯技術(shù)guide-seq方法通過先在體內(nèi)富集摻入 cas9 引入的 dsb 中的寡核苷酸來降低測(cè)序成本。但它的靈敏度較低，并且作為一種基于細(xì)胞的檢測(cè)方法，它既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且僅限于易于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。circle-seq 代表 circularization for in vitro reporting of cleaveage effects by sequencing，它結(jié)合了靈活的體外工作流程和僅選擇性測(cè)序 cas9 切割的 dna 的所有富集優(yōu)勢(shì)。1 隨機(jī)剪切的基因組 dna 被環(huán)化，然后用 cas9 切割. 只有具有切割位點(diǎn)的分子才會(huì)進(jìn)入文庫制備、pcr 擴(kuò)增和 ngs 的后續(xù)步驟，以揭示易受 cas9 切割影響的序列。作為一種體外試驗(yàn)，circle-seq 避免了 crispr qc 基于細(xì)胞的方法中冗長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)步驟。此外，circle-seq 是一種可擴(kuò)展、靈敏的技術(shù)，與其他體外方法相比，需要更少的測(cè)序讀數(shù)，從而降低測(cè)序成本。circle-seq 的成功需要使用 crispr基因編輯試劑等進(jìn)行高效的文庫制備，可減少文庫擴(kuò)增過程中擴(kuò)增偏差的高保真 dna 聚合酶。 基于 ngs 的工具可在每個(gè)階段對(duì) crispr/cas9 介導(dǎo)的編輯進(jìn)行核苷酸水平的驗(yàn)證。
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