摘要 目的:探討nr2b2perk2pelk21途徑是否參與了大鼠各學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)y2迷宮逃避性學(xué)習(xí)和記憶。方
法:健康雄性成年sd大鼠45只,共分為4組:①ifenprodil腹腔注射組（ifenprodilip,14只）,②dmso腹腔注射組
（dmsoip,15只）;③ifenprodil腦室注射組（ifenprodilic,8只）;④dmso腦室注射組（dmsoic,8只）。以y迷宮訓(xùn)
練和測(cè)試成績(jī)作為行為學(xué)評(píng)定指標(biāo),用免疫組織化學(xué)和westernblot方法觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)perk1/2和
pelk21的變化。結(jié)果:ifenprodilip組與dmsoip組動(dòng)物的y迷宮學(xué)習(xí)成績(jī)沒(méi)有明顯差異（p>0.05）,但ifenprodil
ip組y迷宮記憶成績(jī)差于dmsoip組（p<0.05）。腹腔注射ifenprodil導(dǎo)致y迷宮訓(xùn)練后各腦區(qū)perk1/2和
pelk21表達(dá)的普遍下降,其中以海馬、邊緣區(qū)、杏仁核zui為明顯,與dmsoip組相比差異有顯著性（p<0.05）。
ifenprodilic組與dmsoic組*次y迷宮測(cè)試成績(jī)沒(méi)有明顯差異（p>0.05）。*次測(cè)試后立即腦室給藥并在
給藥后6h測(cè)試y迷宮記憶再鞏固成績(jī),發(fā)現(xiàn)ifenprodilic組成績(jī)下降,與dmsoic組相比有明顯差異（p<0.05）,
而且ifenprodilic組動(dòng)物各腦區(qū)的perk1/2和pelk21表達(dá)與dmsoic組相比均普遍下降,其中pelk21表達(dá)在尾殼
核和邊緣區(qū)幾乎*消失。結(jié)論:nr2b對(duì)于大鼠y迷宮長(zhǎng)期記憶的形成、記憶再鞏固過(guò)程是必要的,nr2b的失
活將破壞這些過(guò)程。同時(shí)nr2b的失活減弱了y迷宮訓(xùn)練后及記憶再鞏固測(cè)試后學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)pelk21和
perk1/2表達(dá),其中在尾殼核和邊緣區(qū),nr2b的失活使記憶再鞏固測(cè)試后pelk21表達(dá)*被阻斷。
關(guān)鍵詞: nr2b; perk; pelk21; 學(xué)習(xí)和記憶; 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo); 大鼠
在神經(jīng)元中,胞外信號(hào)反應(yīng)激酶（extracellular
responsekinase,erk）途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和神經(jīng)
元可塑性中起重要作用。erk下游靶目標(biāo)包括突
觸可塑性所必需的轉(zhuǎn)錄因子creb,elk21等。神經(jīng)
元中erk活性被多條胞外信號(hào)途徑的信號(hào)分子所
調(diào)節(jié)。nmda依賴的erk蛋白激酶的激活需要包
含有nr2b亞基的受體通道的開(kāi)放和ca
2+
的進(jìn)入。
ifenprodil作為一種nmda受體拮抗劑,可以
非典型性非競(jìng)爭(zhēng)性地選擇性結(jié)合于nr2b亞單位的
*結(jié)合位點(diǎn),從而選擇性地阻斷含有nr2b亞
基的nmda受體的作用。nr2b亞基特異的nm2
da受體抑制劑ifenprodil以3μmol/l的濃度即可
抑制培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中60%的nmdar電流,同
時(shí)也使70%nmdar依賴的erk的激活受到抑
制[1]
。本實(shí)驗(yàn)即是通過(guò)對(duì)大鼠訓(xùn)練前腹腔注射
ifenprodil和記憶測(cè)試后腦室注射ifenprodil來(lái)觀察
y迷宮學(xué)習(xí)記憶行為的變化并用免疫組織化學(xué)和
westernblot方法觀察ifenprodil對(duì)y迷宮訓(xùn)練后大
鼠各學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)perk1/2和pelk21表達(dá)的
影響,以探討nr2b、perk1/2、pelk21信號(hào)通路是
否參與了y迷宮行為模式的學(xué)習(xí)記憶及記憶的再鞏固。
1 材料與方法
1.1 動(dòng)物
健康雄性成年sd大鼠45只,購(gòu)自*軍醫(yī)大
學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。體重200～300g。保持光照/黑
暗12h循環(huán)恒定,食物由實(shí)驗(yàn)中心提供,飲用自來(lái)
水。
1.2 實(shí)驗(yàn)分組
動(dòng)物共分為4組:（1）ifenprodil腹腔注射組（ifenprodilip,14只）;（2）,dmso腹腔注射組（dm2
soip,15只）,此2組中分別有7只動(dòng)物在訓(xùn)練后立
即處死,用來(lái)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色;（3）ifenprodil
腦室注射組（ifenprodilic,8只）;（4）dmso腦室注
射組（dmsoic,8只）,分別在記憶測(cè)試后立即給與
腦室注射。
1.3 手術(shù)與給藥
腹腔注射動(dòng)物在訓(xùn)練前15min給藥。將ifen2
prodil溶于二甲基亞砜（dmso）中,濃度為1.2mg/ml,注射量3mg/kg;dmso腹腔注射組注射同樣體
積dmso。
腦室注射組動(dòng)物在第2d記憶測(cè)試后立即經(jīng)腹
腔注射10%*（0.4ml/100g）,固定于腦立
體定位儀上,雙側(cè)腦室鉆孔（坐標(biāo):前囟后1.6mm,
中線兩側(cè)2.0mm,深3.5mm）,將藥物通過(guò)玻璃電
極垂直緩慢注入,并留針10min。ifenprodil溶于
dmso中,濃度為2.0μg/μl,每側(cè)注射0.5μl;dm2
so腦室注射組注射同樣體積dmso。
1.4 電y迷宮中厭暗逃避反射訓(xùn)練電y型迷宮三條臂的盡頭均有一燈,底部是電
網(wǎng),實(shí)驗(yàn)時(shí)其中有一條臂末端的燈發(fā)出亮光,此時(shí)該
臂底部電網(wǎng)無(wú)電流通過(guò),為安全區(qū);另兩臂末端的燈
不亮,底部電網(wǎng)通電（約50～70v）,為非安全區(qū)。
安全區(qū)與非安全區(qū)隨機(jī)改變。每當(dāng)大鼠到達(dá)安全區(qū)
30s后再隨機(jī)改變安全區(qū)的位置,轉(zhuǎn)變5s后非安
全區(qū)底部電網(wǎng)即有脈沖電流通過(guò),刺激正常大鼠足
底而驅(qū)使其跑向安全區(qū)。大鼠在10s內(nèi)從非安全
區(qū)一次性跑向安全區(qū)即被判為正確,否則均判為錯(cuò)
誤。*天訓(xùn)練在每只大鼠上重復(fù)60次,記錄正確
次數(shù)。少于25次視為不合格,棄去并及時(shí)補(bǔ)充動(dòng)
物。ifenprodilip組及其對(duì)照dmsoip組在訓(xùn)練前15min腹腔注射。訓(xùn)練結(jié)束24h后（第二天）進(jìn)行
y迷宮測(cè)試30次,記錄正確次數(shù)。ifenprodilic和
dmsoic組在y迷宮測(cè)試后立即進(jìn)行腦室注射,并
在6h后測(cè)試動(dòng)物y迷宮記憶的再鞏固。
1.5 免疫組織化學(xué)標(biāo)本取材和染色
腹腔注射組動(dòng)物進(jìn)行第二天測(cè)試后立即腹腔內(nèi)
注射10%*（4mg/100g）麻醉動(dòng)物。經(jīng)主
動(dòng)脈4%多聚甲醛灌注固定。冠狀冰凍切片,厚度
35μm。常規(guī)abc法染色,一抗分別為兔抗單克隆
perk1/2抗體（1∶200,cellsignalingtechnology公
司）和兔抗多克隆pelk21抗體（1∶100,cellsignaling
technology公司）。采用硫酸鎳銨增強(qiáng)的二氨基聯(lián)
苯胺（gdn）法顯色。陰性對(duì)照用正常二抗同源血
清代替一抗,其它步驟相同。
1.6 數(shù)據(jù)的采集
pelk21免疫陽(yáng)性神經(jīng)元使用scionimage圖像
分析系統(tǒng),每只動(dòng)物每個(gè)腦區(qū)選取5張切片,每張切片選擇一個(gè)代表性視野在200倍光鏡下檢測(cè)平均光
密度。每只動(dòng)物所選取切片層面基本相同,zui后計(jì)
算每組大鼠每個(gè)腦區(qū)pelk21免疫陽(yáng)性神經(jīng)元平均
光密度。perk1/2免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)在olympus顯微鏡100x物鏡下進(jìn)行,每只動(dòng)物所取切片層面
基本相同,數(shù)目相同,各腦區(qū)均取5張連續(xù)切片,獲
得該區(qū)陽(yáng)性神經(jīng)元均數(shù),zui后計(jì)算每組大鼠每個(gè)腦
區(qū)perk1/2免疫陽(yáng)性神經(jīng)元平均數(shù)。
1.7 westernblot
腦室注射組記憶再鞏固測(cè)試后立即斷頸取腦,
置干冰上分離嗅球、前額葉、尾殼核、邊緣區(qū)、海馬、
小腦組織。低溫勻漿,4℃,10000×g離心1h,
bradford法測(cè)蛋白濃度,變性后-80℃保存。sds2
page電泳:8%分離膠,5%分離膠,電泳完畢在半
干電轉(zhuǎn)儀上將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,常規(guī)蛋白
免疫印跡染色,一抗分別為兔抗perk1/2抗體（1∶
1000,cellsignalingtechnology公司）及兔抗pelk21抗體（1∶1000,cellsignalingtechnology公司）,zui
后采用硫酸鎳銨增強(qiáng)的二氨基聯(lián)苯胺（gdn）法顯
色。scionimage圖象處理軟件分析各泳道perk1/
2和蛋白條帶光密度（od）值以及各自的參照泳道
od值。計(jì)算待檢測(cè)泳道perk1/2和pelk21泳道
與各自相應(yīng)的參照泳道的od比值。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（…x±s）表示,統(tǒng)計(jì)分
析軟件采用spss13.0,組間分析采用one2way
anova。2 結(jié)果
2.1 訓(xùn)練前腹腔注射ifenprodil對(duì)大鼠y迷宮學(xué)習(xí)
及24h后y迷宮記憶的影響
訓(xùn)練前15min腹腔注射ifenprodil組動(dòng)物的y
迷宮學(xué)習(xí)成績(jī)與dmsoip組相比,沒(méi)有明顯差異
（p>0.05）,但是在24h后測(cè)試動(dòng)物的y迷宮記
憶,ifenprodilip組成績(jī)差于dmsoip組成績(jī)（p<
0.05,表1）
tab.1 effectofifenprodilperitonealinjectionbeforetraining
onraty2mazememory（times,…x±s）
groupnumber
y2mazescore
trainingtest
ifenprodilip735.42±5.7417.71±2.693
dmsoip835.00±3.6621.75±3.692.2 訓(xùn)練前腹腔注射ifenprodil對(duì)各學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦
區(qū)perk1/2和pelk21表達(dá)的影響
y迷宮訓(xùn)練后立即取標(biāo)本檢測(cè)兩組大鼠perk1/2
和pelk21在各腦區(qū)的表達(dá)差異