桉樹組培技術(shù)詳細(xì)說(shuō)明 組織培養(yǎng)指以分離出植物各部分的組織，如分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮、皮層、胚乳組織、髓部等或已誘導(dǎo)的愈傷組織為外植體的離體無(wú)菌培養(yǎng)。桉樹組織培養(yǎng)研究始于60年代，據(jù)報(bào)道，有20多種桉樹可通過(guò)植株的不同部分，種子、下胚軸、幼苗的根、莖段、葉柄、葉片、莖尖、結(jié)節(jié)、花藥、樹皮外植體和花粉粒等。通過(guò)組織培養(yǎng)形成愈傷組織，目前，桉樹組織培養(yǎng)發(fā)展很快，已解決了連續(xù)培養(yǎng)小植株的器官發(fā)生，試管苗的移栽和移栽后生長(zhǎng)等一系列關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。
桉樹組培獲得成功，主要解決了一些難以生根的樹種或無(wú)法采用扦插方法增繁無(wú)性系的繁殖問(wèn)題，加快優(yōu)良無(wú)性系化的繁殖速度，同時(shí)無(wú)性系組培苗可直接上山造林，但組培技術(shù)操作要求嚴(yán)格，采用無(wú)菌操作，且成本較高，對(duì)大面積造林來(lái)說(shuō)不利于產(chǎn)出的經(jīng)濟(jì)效益，因此目前生產(chǎn)單位通常使用組培方法培育扦插母株作為扦插擴(kuò)大材料，然后通過(guò)扦插繁殖生產(chǎn)大量苗木營(yíng)建速生豐產(chǎn)林與諸如嫁接苗芽條和萌芽條等相比，組培苗芽條的幼態(tài)化最佳，有分生機(jī)能的薄壁細(xì)胞活躍、再生能力比較強(qiáng)、扦插更容易生根成活。
一實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及其操作
桉樹組織培養(yǎng)是一項(xiàng)技術(shù)性很強(qiáng)的工作，無(wú)菌條件要求嚴(yán)格，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及人員的操作技術(shù)要求較高，組培實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備下列設(shè)備。
第一洗滌設(shè)備、設(shè)置洗滌室、洗滌劑及各種洗滌工具
第二滅菌設(shè)備、設(shè)置高壓高溫滅菌鍋、烘箱等
第三化學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、設(shè)置實(shí)驗(yàn)臺(tái)架、藥品柜、冰箱、離心機(jī)、天平、各種、玻璃器皿、ph計(jì)、攪拌器、蒸餾器等
第四無(wú)菌操作設(shè)備、設(shè)置無(wú)菌室、超凈臺(tái)、接種箱、超凈室及接種工具、鑷子、剪刀、解剖刀、接種鏟及酒精燈等
第五培養(yǎng)設(shè)備、設(shè)置培養(yǎng)箱室、培養(yǎng)容器、三角瓶、試管、罐頭瓶等
二培養(yǎng)基及其附加成分
植物組織培養(yǎng)應(yīng)用的培養(yǎng)基，一般都包括大量元素、微量元素和碳水化合物，并添加各種各樣的附加物，如維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等。
桉樹芽的誘導(dǎo)可選用white、b5h、n6、和ms等作基本培養(yǎng)基、胚狀體的誘導(dǎo)可選用b5h及改良h等作基本培養(yǎng)基。
三桉樹組培技術(shù)
桉樹組織培養(yǎng)技術(shù)通常有兩種方法一是取植株嫩莖段或不定芽接種培養(yǎng)形成愈傷組織分化長(zhǎng)成完整植株二是取無(wú)菌種子或無(wú)茵發(fā)芽后的苗段誘導(dǎo)胚狀體。
生長(zhǎng)成完整植株。
1愈傷組織形成和分化
1外植體的采集
采集對(duì)象為嫁接苗或伐樁、環(huán)割、萌芽條、截取具有半木質(zhì)化程度的嫩梢長(zhǎng)度為5~10cm試驗(yàn)證明，3~5月份桉樹萌芽率較高，莖部積累有較豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和內(nèi)源激素，受病蟲侵害較少、外植體誘導(dǎo)成功率最高，7~9月份屬高溫高濕季節(jié)，水分、溫度都較高、病蟲十分活躍、莖段機(jī)械損傷較多、易受病、蟲菌的侵害污染，誘導(dǎo)成功率最低，因此外植體采集最好是在春季進(jìn)行，以芽條腋芽開始膨大，芽鱗片還未裂開時(shí)為最佳時(shí)機(jī)，芽條在植株上的部位也是誘導(dǎo)芽能否成功的重要因素，試驗(yàn)證明，萌芽條中上部的莖段，第5~第7節(jié)最好，（中下部第8~第10節(jié)）莖段木質(zhì)化程度較好。芽不易萌動(dòng)、易褐化、梢部因芽組織幼嫩、消毒時(shí)易被殺傷、褐化嚴(yán)重，另外，枝條修剪萌發(fā)的枝條，且用抗菌素溶液和殺菌劑預(yù)處理后誘導(dǎo)效果也不錯(cuò)。
2外植體消毒
將采回的桉樹嫩莖段剪去葉片，用自來(lái)水洗干凈，在無(wú)菌條件下用70%酒精浸泡10秒鐘，再用新潔爾滅溶液或0.1升汞溶液浸5~6分鐘消毒，用無(wú)菌水沖洗4~5次，然后切取含1~2個(gè)腋芽的莖段接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，試驗(yàn)證明，重復(fù)消毒一次效果更佳。
3褐變及其預(yù)防
桉樹莖段接種后，如切口處產(chǎn)生褐色滲出物，使莖段周圍的培養(yǎng)基變成棕褐色，莖段在培養(yǎng)基內(nèi)的基部變褐色就會(huì)失去生命力，導(dǎo)致外植體死亡、嚴(yán)重地影響了外植體誘導(dǎo)的成功率，可采取以下措施綜合防治。盡量避免組織傷害，用于切割的解剖刀應(yīng)盡可能鋒利，切割外植體時(shí)，把組織浸于水中隔絕空氣、切面要垂直、切口的損傷要減至最低的限度，接種時(shí)選擇表面消毒過(guò)程中沒(méi)有損傷的莖段，注意不讓腋芽附著培養(yǎng)基，利用漫射光培養(yǎng)，由于光能提高多氧化酶的活性，從而促進(jìn)多酚化合物的氧化，因此在弱光下培養(yǎng)，能有效地降低多酚氧化物的氧化。及時(shí)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，當(dāng)發(fā)生褐變時(shí)應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，使褐化不影響腋芽周
圍的組織，外植體仍有萌動(dòng)的生命力。
4芽的誘導(dǎo)
將含有腋芽的莖段接種在1/2ms+0.5mg/lba+1mg/liba的培養(yǎng)基上，在26下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)20~30天培養(yǎng)，可形成肉眼可見的愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)95%以上，愈傷組織多發(fā)生在切口處、呈顆粒狀、緊密、也可發(fā)生在非切口處、呈瘤狀、疏松。
5芽的增殖
將愈傷組織轉(zhuǎn)移到ms+0.5mg/lba+0.25mg/liba的培養(yǎng)基上，在此條件下兩種愈傷組織都可形成芽，但瘤狀愈傷組織多產(chǎn)生叢生型芽，不能抽莖和展葉顆粒狀愈傷組織形成單生型芽、芽多而密集、能抽莖和展葉。
6生根苗的誘導(dǎo)
當(dāng)苗高2~3cm時(shí)，即可進(jìn)行生根的誘導(dǎo)，一般一個(gè)500ml的三角瓶有400~600
個(gè)芽條，能夠做生根的有效芽為30~60條，切取健壯的芽條轉(zhuǎn)移到white+0.2~1mg/liba+40mg/l，腺嘌呤+2%蔗糖或white+0.5mg/liba+4%蔗糖的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在室內(nèi)散射光照條件，光照強(qiáng)度為2000~3000lx下，1~2周即開始發(fā)根，然后利用較強(qiáng)的自然散射光照光照強(qiáng)度為3000~5000lx進(jìn)行培養(yǎng)10天左右，即可在苗的基部產(chǎn)生根而形成完整植株，一般發(fā)根率可達(dá)80%以上。
2胚狀體的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)
第一取無(wú)菌種子或無(wú)菌發(fā)芽后的苗段接種在b5h或改良h成分為nh4no348.8mg/lkno341.6mg/l其余的與b5的成分相同，加0.8~1.0mg/lkin+2mg/l~4mg/l2.4-d+4%~5%蔗糖的固體培養(yǎng)基上，放在28氣溫環(huán)境和12小時(shí)光照下培養(yǎng)3~4天可產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)20余天迅速增殖成紅里帶白色的愈傷組織。
第二把上述愈傷組織及時(shí)移到h或改良h+0.2~1.0mg/lba+0.5mg/lnaa+3%~5%蔗糖的固體培養(yǎng)基上,在光和28下培養(yǎng)，這時(shí)愈傷組織增殖速度減慢培養(yǎng)1~2周，逐漸呈粉紅色、表面光滑、結(jié)構(gòu)致密、生機(jī)勃勃、再經(jīng)3~6周培養(yǎng)愈傷組織表面更光滑，呈紫紅色顆粒狀，它就是胚性細(xì)胞團(tuán)，從中可分化出許多胚狀體。
第三把這些細(xì)胞團(tuán)接種在h或改良h+0.2mg/lba+0.5mg/lnaa+3%~5%蔗糖的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)約10~30天可長(zhǎng)出大量綠苗、但發(fā)根少、因此把它移入h或改良h+0.5mg/l~1.0mg/liba+3%蔗糖的固體培養(yǎng)基上在28和光下培養(yǎng)6~8天，便會(huì)長(zhǎng)成根系發(fā)達(dá)的完整苗木。
第四桉樹胚性細(xì)胞團(tuán)可以較長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)而不喪失分化能力但愈傷組織繼代三次就會(huì)喪失分化能力繼代用的培養(yǎng)基仍為前述的分化培養(yǎng)基繼代時(shí)的胚性細(xì)胞團(tuán)的大小,以0.1~0.2cm3為宜繼代周期為15~30天以20天左右最佳。
3組培幼苗的移植
桉樹組培苗經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)生根成苗其木質(zhì)化程度還非常低瓶苗從無(wú)菌，光照、溫度恒定、濕度飽和的人工控制培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)入有菌、光、溫、濕不易控制的外界環(huán)境時(shí)，這個(gè)過(guò)程使幼苗自身葉片的光合能力和根的主動(dòng)吸收能力逐漸增強(qiáng)，葉片表面的保護(hù)層也逐漸形成，這時(shí)幼苗才算完成了從異養(yǎng)到自養(yǎng)的轉(zhuǎn)變過(guò)程，因此，組培幼苗的移植必須按一定程序逐步進(jìn)行。瓶苗發(fā)根率達(dá)80%以上時(shí)可移到室外在自然光下再培養(yǎng)6~10天，當(dāng)小苗充分木質(zhì)化，葉片舒展、葉色濃綠、莖軸、根系伸長(zhǎng)時(shí)即可移栽出瓶外，育苗容器與
基質(zhì)配比與扦插苗培育相同，移栽前用0.15%~0.3%的高錳酸鉀溶液進(jìn)行基質(zhì)消毒,倒出培養(yǎng)基，小心洗去殘留在根上的培養(yǎng)基，并截去過(guò)長(zhǎng)的根，保留2cm左右用0.1%的殺菌劑進(jìn)行小苗消毒處理，根部再經(jīng)iba生根激素溶液處理后移入育苗基質(zhì)中，置于育苗架上在70%遮光度的蔭棚內(nèi)培育25~30天移植初期要覆蓋塑料薄膜保溫保濕，等小苗高3cm生長(zhǎng)穩(wěn)定后即可進(jìn)行露天煉苗當(dāng)小苗長(zhǎng)至15~20cm時(shí)可以出圃造林或用作扦插母株。
同時(shí)在移栽過(guò)程中幼苗抗逆性差極易感霉菌死亡因此在高溫高濕的溫室或覆蓋塑料薄膜的苗床上培育移植苗時(shí)，要注意溫室或苗床的通透性，每周用0.1%的多菌靈等殺菌劑噴一次消毒滅菌。