逆轉(zhuǎn)錄酶(rt-pcr)是存在于 rna 病毒體內(nèi)的依賴 rna 的 dna 聚合酶。rt-pcr 實驗中的逆轉(zhuǎn)錄酶需要具有以下三種活性：
1.依賴 rna 的 dna 聚合酶活性：以 rna 為模板合成 cdna 的第一條鏈；
2.rnase 水解活性：水解 rnase 雜合體中的 rna;
3.依賴 dna 的 dna 聚合酶活性：以一條 dna 鏈為模板合成互補的雙鏈 dna。
在選擇逆轉(zhuǎn)錄酶時，建議選擇無 rnaseh①活性（rnaseh-）的逆轉(zhuǎn)錄酶。具有 rnaseh 活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的 rnaseh 活性會與聚合酶活性競爭 rna 模板與 dna 引物（或 cdna 延伸鏈）形成的雜合鏈，并降解雜合鏈中的 rna 鏈。被rnaseh 活性所降解的 rna 模板不能再作為合成 cdna 的有效底物，降低了 cdna 合成的產(chǎn)量與長度。
一、實驗流程：
1、從細胞材料中提取 rna→rna 加入到含有逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dntps 的反應體系中→退火，引物與 rna 鏈配對→延伸，逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補 cdna 鏈變性→常規(guī)pcr反應流程（變性、退火、延伸，如此多次循環(huán)）。
2、rt-pcr“兩步法”與“一步法”
rt-pcr 的實驗操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。一步法 rt-pcr 能克隆微量 mrna 而不需構建 cdna 文庫（即 cdna 合成與 pcr 反應在同一 buffer 及酶中進行，一步法完成），省略了 cdna 與 pcr 之間的過程。兩步法 rt-pcr 首先用反轉(zhuǎn)錄酶合成 cdna，然后以 cdna 為模板進行 pcr，即 rna 反轉(zhuǎn)錄與 pcr 擴增分兩步進行。一步法 rt-pcr 與兩步法相比快速、簡便、減少了污染機會、減少了 rna 二級結構、減少了 pcr 反應的錯配率。rt-pcr 兩步法的優(yōu)勢在于存在中間產(chǎn)物 cdna，便于保存；且第二步 pcr 只取逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物的 1/10 進行反應，有利于 pcr 條件的調(diào)整，實驗重現(xiàn)性強；兩步法可以在第二步 pcr 反應體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高；兩步法的實驗預算要低于一步法。但是由于兩步法包括第一鏈 cdna 合成和隨后的 pcr 反應，容易產(chǎn)生污染問題。
二、實驗操作注意事項：
1、 rna 提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；
2、 rna 提取完馬上進行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延，新提的 rna 很容易降解；
3、逆轉(zhuǎn)錄反應過程，需建立無 rnaase 環(huán)境，以避免模板 rna 降解；