信帆生物細說:t細胞亞群檢測試劑盒的樣本制備方法以及操作步驟
信帆生物供應t細胞亞群檢測試劑盒,可以用于檢測cd3,cd4,cd8,試劑盒配抗體,試劑盒操作簡單,資料穩(wěn)定,深受廣大用戶青睞,歡迎大家咨詢!
t 細胞亞群檢測試劑盒說明書
一:試劑盒組成:
1.防脫片劑2ml
2.固定液10ml
3.a 小鼠抗人 cd3 單抗1ml
b 小鼠抗人 cd4 單抗1ml
c 小鼠抗人 cd8 單抗1ml
4.生物素標記羊抗小鼠 igg( igg/bio)1.5ml × 2
5.堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素(s-a/ap)1.5ml × 2
6.a 底物增強劑(40×)200μl
b 底物液(40×)200μl
c 底物緩沖液(10×)800μl
7.細胞核復染液5ml
8.封片劑1ml
9.記號筆1 支
10.pbs2 包(1000ml)
二:標本制備:
取肝素抗凝(25μl/ml)的靜脈血 1~2ml,pbs 稀釋 1-2 倍后,沿裝有等量淋巴
細胞分離液的試管壁混勻緩慢加至液面上層,保持兩種液體界面清晰,離心(2000
轉(zhuǎn)/分)15-20 分鐘,吸取兩液面交界處的單個核細胞層,加 5 倍 pbs,離心(1000
轉(zhuǎn)/分)5 分鐘,棄上清液,沉淀即為單個核細胞。利用試管中剩余的少許回流
液體(約一滴)混勻細胞,制成單個核細胞懸液。滴 30μl 細胞懸液于載玻片上,
靜置 2 分鐘使細胞下沉粘附于玻片上,吸去液體,快速吹干或 37℃溫箱 1 小時
烤干?;蛴?pbs 將單個核細胞調(diào)至 2×105個/ml,離心涂片機 1000 轉(zhuǎn)離心 1-2
分鐘制片,快速吹干或 37℃溫箱 1 小時烤干。涂片前取防脫片劑 5-10μl 均勻
推片,亦可用棉簽粘取防脫片劑均勻涂于干凈玻片上,待干后制備細胞涂片,以
防掉片。
三:顯色劑的配制:
分別取 a 液 25ul,b 液 25ul 置于干凈試管中混勻,室溫放置 2-5 分鐘,加 1ml
蒸餾水,混勻,再加 c 液 100ul 待用。
*使用前,根據(jù)所需顯色劑用量,按照以上比例現(xiàn)配現(xiàn)用。
四:標本染色:
1. 充分干燥(室溫 2 小時以上或過夜)的細胞涂片先用記號筆在標本外畫
圈,然后滴加固定液 50μl,室溫靜置 2-3 分鐘,用 pbs 淋洗,擦干玻片背面及
細胞外的 pbs。
*以下反應均需在濕盒中進行。
2. 分別滴加抗人 cd3、cd4、cd8 單抗適量(10-30μl),4℃過夜,pbs 淋洗 3 次。
3. 滴加生物素標記抗小鼠 igg 適量(10-30μl),37℃孵育 30-45 分鐘,pbs
淋洗 3 次。
4. 滴加堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素適量(10-30μl)37℃孵育 30-45 分鐘,pbs
淋洗 3 次。
5. 滴加顯色劑 30-50μl,室溫顯色 20-40 分鐘??稍陲@微鏡下觀察,待細胞膜
上出現(xiàn)紅色標記物時,用 pbs 淋洗。
6. 滴加細胞核復染液 30-50μl,30 秒后自來水淋洗。
7. 滴加封片劑,蓋片封片,鏡檢。如不需保存亦可用水替代封片劑蓋片鏡檢。
五:觀察:
高倍鏡下選取染色好的視野記數(shù) 100-200 個單個核細胞,細胞表面有紅色標記物
為陽性細胞。算出陽性率。
六:正常參考值:
正常人外周血中,陽性細胞百分率一般在:cd3,60-80%;cd4,35-55%;cd8,
20-30%;cd4/cd8 的比值在 1.5-2.0 范圍內(nèi)。
七:儲存條件及有效期:
2-8℃保存,禁止冷凍,有效期為 12 個月。有效期內(nèi)可在 0-25℃范圍內(nèi)七天短
時運輸。使用時應及時及拿及用,使用后應立即放回冰箱。生產(chǎn)日期,使用期限
或失效日期見標簽。
八:注意事項:
1. 免疫細胞化學檢測是一種包含多步驟的檢測方法,試劑的選擇、樣本的處理、
涂片的制備、染色及其結(jié)果的判讀均需要進行專業(yè)的培訓。
2. 任何陽性或陰性的解讀,應由病理科醫(yī)生結(jié)合病理形態(tài)學,臨床表現(xiàn)及其它
檢測方法進行,不作為單獨的診斷指標。
3. 復染過度或不足都可能影響結(jié)果的判讀。
4. 陰性結(jié)果表示未檢出抗原,不一定表示樣本中無該抗原存在,待測抗原編碼
基因變異,抗原低表達或抗原修復不當?shù)?,都會造成抗原無法檢出。
5. 本試劑僅對經(jīng)處理的人外周血細胞進行驗證,不做其他用途
6. 試劑盒使用中,應有適當?shù)姆雷o措施,以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。
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