中華人民共和國國家標準
gb/t 19539-2004
飼料中赭曲霉毒素a的測定
determination of ochratoxin a in feeds
前言
本標準中的薄層色譜方法和酶聯(lián)免疫吸附測定方法主要依據(jù)gb/t 5009.96-2003《谷物和大豆中赭曲霉毒素a的測定》中薄層色譜方法和衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所建立的酶聯(lián)免疫吸附法。本標準規(guī)定以薄層色譜法為仲裁方法，酶聯(lián)免疫吸附測定法為快速篩選法。
本標準由全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會提出。
本標準由全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。
本標準由江蘇省微生物研究所負責(zé)起草。
本標準主要起草人：宓曉黎、袁建興、李利東、丁貴平、成恒嵩。
1范圍
本標準規(guī)定了赭曲霉毒素a（ochratoxin a，以下簡稱oa）的薄層色譜測定方法和酶聯(lián)免疫吸附測定方法。
本標準適用于配合飼料、飼用谷物原料中oa的測定。
薄層色譜測定方法的最（zui）低檢測量為2ng，酶聯(lián)免疫吸附測定方法的最（zui）低檢測量為0.05ng。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
gb/t 14699.1飼料采樣方法
3薄層色譜法（仲裁法）
3.1 原理
試樣中的oa經(jīng)提取、液-液分配萃取、濃縮，然后進行薄層分離，限（xian）量定量，或用薄層掃描儀測定熒光斑點的熒光強度，外標法定量。
3.2試劑與材料
所用試劑除另有規(guī)定，均使用分析純試劑。水符合gb/t6682中一級水的規(guī)定。
3.2.1石油醚。
3.2.2 甲醇溶液（55+45）。
3.2.3三氯（lv）甲烷。
3.2.4苯-冰乙酸（99+1）。
3.2.5 40g/l氯化鈉溶液。
3.2.6 無水硫酸鈉：650℃灼燒4 h，冷卻后貯于干燥器中備用。
3.2.7展開劑（用時選擇一種）：
a）甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（6+3+1.2+0.06）；
b）甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6+3+1.4）；
c） 苯-冰乙酸（9+1）。
3.2.8 顯色劑：碳酸氫鈉乙醇溶液（在100 ml水中溶解6.0 g碳酸氫鈉，加20 ml乙醇）。
3.2.9薄層板：稱取4g硅膠g，加約10ml 0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液于乳缽中研磨至糊狀。立即倒入涂布器內(nèi)制成10 cm×20 cm、厚度0.3 mm的薄層板，在空氣中干燥后，用甲醇預(yù)展薄層板，除去雜質(zhì)，吹干，在105℃~110℃活化1 h，置于干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br>3.2. 10 oa標準儲備溶液：
警告：
1凡接觸oa的容器，需浸入4%次氯酸鈉（naocl）溶液，半天后清洗備用。
2為了安全，分析人員操作時要帶上醫(yī)用乳膠手套。
稱取適量的oa標準品，用苯-冰乙酸（3.2.4）配制成約10μg/ml oa貯備液。貯備液置于4℃冰箱中避光保存。
標定貯備液的濃度，用1 cm石英比色杯，以苯-冰乙酸（3.2.4）為參比，在0a的最大吸收峰波長333 nm處，測定吸光度值a。儲備液中oa的含量（x1）以微克每毫升（μg/ml）表示，按式（1）計算。
式中：
a——測定的吸光度值；
m——oa的摩爾質(zhì)量（m=403 g/mol）；
ε——oa在苯冰乙酸中的分子吸收系數(shù)（ε=555 m2/mol）；
δ——比色杯的光徑長度，單位為厘米（cm）。
3.2.11 oa標準工作溶液：根據(jù)計算的oa標準儲備液的濃度，精密吸取標準儲備液（3.2.10）適量，用苯稀釋成濃度為1.0 μg/ml的標準工作溶液。
3.3 儀器與設(shè)備
3.3.1小型粉碎機。
3.3.2電動振蕩器。
3.3.3 薄層板涂布器。
3.3.4玻璃器皿：分液漏斗、蒸發(fā)皿、濃縮瓶。所有玻璃器皿均需用稀鹽酸浸泡，依次用自來水、蒸餾水沖洗。
3.3.5 快速定性濾紙。
3.3.6 展開槽：250 mm×150 mm×50 mm（立式，具磨口）。
3.3.7紫外光燈：波長365 nm。
3.3.8點樣器：1 μl~99 μl.
3.3.9薄層掃描儀：配有汞燈光源。
3.4試樣制備
按gb/t 14699.1飼料采樣方法取得試樣，四分法濃縮臧取約200 g，經(jīng)粉碎，混勻，裝入磨口瓶中備用。
3.5 分析步驟
3.5.1試樣處理
稱取約20 g試樣（3.4）（精確至0.01 g），置于200 ml具塞錐形瓶中，加30 ml石油醚和100 ml甲醇溶液（3.2.2），瓶塞蓋緊。振蕩30 min后，通過快速定性濾紙濾入分液漏斗中，待分層后，放出甲醇水層20 ml，置于100 ml分液漏斗中，用ph試紙測試，一般為5~6。加入25 ml三氯（lv）甲烷，振搖2 min，靜置分層后，放出三氯（lv）甲烷層于另一個分液漏斗中，再用10 ml三氯（lv）甲烷重復(fù)振搖提取甲醇水層（在用三氯（lv）甲烷振搖提取時，如發(fā)生乳化現(xiàn)象，可滴加甲醇促使其分層），將三氯（lv）甲烷層合并于同一分液漏斗中，加入50ml~100ml氯化鈉溶液（3.2.5），振搖，放置分層后，將三氯（lv）甲烷層放出，經(jīng)裝有約20 g無水硫酸鈉的玻璃漏斗流入蒸發(fā)皿中，將蒸發(fā)皿置蒸氣浴上通風(fēng)揮干。用約8 ml三氯（lv）甲烷分次將蒸發(fā)皿中的殘渣溶解，轉(zhuǎn)入濃縮瓶中，置60℃水浴減壓濃縮至干，加℃2 ml苯冰乙酸（3.2.4）溶解殘渣，搖勻，供薄層色譜點樣用。
3.5.2 點樣
在距薄層板下端1.5cm~2cm的基線上，以1cm的間距，用點樣器依次點標準工作溶液（3.2.11）2μl、4μl、7μl、10μl（相當(dāng)于2 ng、4 ng、7 ng、10 ng）和試樣液（3.5.1）20μl。
3.5.3 展開
將薄層板放入有展開劑的展開槽中，展至離原點13 cm~15 cm，取出，吹干。
3.5.4 觀察與確證
將展開后的薄層板置于波長365nm紫外光燈下，觀察與oa標準點（4ng）比移值相同處的試樣的藍綠色熒光點。若相同位置上未出現(xiàn)熒光點，則試樣中的oa含量在本測定方法的最（zui）低檢測量100μg/kg以下。如果相同位置上出現(xiàn)熒光點，用顯色劑對準各熒光點進行噴霧后吹干，觀察熒光點由藍綠色變?yōu)樗{紫色且熒光強度明顯加強可確證試樣中含有oa。于熒光點下方用鉛筆標記，待掃描定量測定。
3.5.5 定量測定
3，5.5. 1薄層掃描工作條件
光源：高壓汞燈；
激發(fā)波長：365nm；
發(fā)射波長：450 nm；
檢測方式：反射；
狹縫：可根據(jù)斑點大小進行調(diào)節(jié)；
掃描方式：距齒掃描。
3.5.5.2 標準曲線繪制
以oa標準工作溶液質(zhì)量（ng）為橫坐標，以峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。
3.6 結(jié)果計算和表述
根據(jù)試樣液熒光斑點峰面積掃描積分值從標準曲線上查出對應(yīng)的oa質(zhì)量（ng），試樣中oa的含量（x）以微克每千克（μg/kg）表示，按式（2）計算。
式中：
v1——試樣液（3.5. 1）最后定容體積，單位為微升（μl）；
v2——試樣液點樣體積，單位為微升（μl）；
m1——從標準曲線上查得試樣液點上對應(yīng)的oa的質(zhì)量，單位為納克（ng）；
m0——最后提取液相當(dāng)試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。
計算結(jié)果表示到小數(shù)點后一位有效數(shù)字。
3.71復(fù)性
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的相對差值不大于10%。
4酶聯(lián)免疫吸附測定法（怏速篩選法）
4.1原理
方法的檢測依據(jù)是抗原抗體反應(yīng)。將oa抗體的羊抗體吸附在固相載體表面，加入oa抗體、酶標oa結(jié)合物、oa標準或試樣液，在oa抗體與固相載體表面羊抗體結(jié)合的同時，游離的oa、酶標oa結(jié)合物與結(jié)合在固體表面oa抗體競爭，未結(jié)合的酶標oa結(jié)合物洗滌除去。加入酶底物，在結(jié)合酶的催化作用下，無色底物降解產(chǎn)生有藍色物質(zhì)。加入終止劑后顏色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。通過酶標檢測儀，在450nm波長處測吸收值。吸光強度與試樣中oa的濃度成反比。
酶聯(lián)免疫吸附測定法具有操作簡單，快速靈敏，結(jié)果可靠的特點。目前有專門測定oa的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的商品。在分析時適當(dāng)參考操作說明書。
4.2試劑與材料
4.2.1 包被抗體的聚苯乙烯微量反應(yīng)板24孔或48孔。
4.2.2 70% 甲醇溶液。
4.2.3 oa標準溶液：精密吸取標定后的標準儲備液（3.2.10）適量，用甲醇溶液（4.2.2）配制成oa標準溶液1~5，濃度分別為0 μg/l、1 μg/l、2 μg/l、4 μg/l、8 μg/l。
4.2.4 酶標抗原溶液：oa與辣根過氧化酶結(jié)合物。
4.2.5抗體溶液：oa抗體。
4.2.6檸檬酸緩沖溶液[c（na3c6h5o7）=0.1 mol/l，ph=4.0]：稱取10.147 1 g檸檬酸鈉（na3c6h5o7·2h2o），13. 764 2 g檸檬酸（c6h8o7•h2o）加水溶解至1 l。
4.2.7底物溶液甲：四甲基聯(lián)苯胺，用檸檬酸緩沖溶液（4.2.6）配成濃度為0.4g/l。
4.2.8底物溶液乙：取 1.5 ml 30%過氧化氫，用檸檬酸緩沖溶液（4.2.6）稀釋至1 l。
4.2.9底物溶液：底物溶液甲與底物溶液乙1 ： 1的混合液。
4.2.10終止液：硫酸溶液（1+17）。
4.3儀器與設(shè)備
4.3.1酶標測定儀：帶 450 nm波長。
4.3.2小型粉碎機。
4.3.3 50μl、100μl、1000μl微量移液器。
4.3.4電動振蕩器。
4.3.5 玻璃器皿：50 ml錐形瓶、漏斗、量筒。
4.3.6快速濾紙。
4.4試樣制備
同3.4。
4.5分析步驟
4.5.1試樣處理
稱取約5 g試樣（4.4）（精確至0.01 g），置于50 ml具塞錐形瓶中，加入12.5 ml甲醇溶液（4.2.2），密塞。振蕩器（4.3.4）提取5 min。提取液通過快速濾紙過濾，敢1 ml濾液，加9 ml蒸餾水稀釋，搖勻，為試樣液。
4.5.2分析前注意事項
分析前將所有試劑平衡至室溫；分析后立即將所有試劑放回2℃~8℃冰箱；在所有培育中，避光，蓋上微孔板蓋。
4.5.3定位
根據(jù)需要設(shè)定限（xian）量法（如表1）和定量法（如表2）。取足夠數(shù)量的微孔置微孔架上，標準品和試樣做兩個平等實驗，記錄標準品孔和試樣孔的位置。限（xian）量法時控制標準品孔號中的濃度為限（xian）量值/稀釋因子，并通過調(diào)節(jié)稀釋因子使之濃度在0 μg/l~8 μg/l范圍內(nèi)。
4.5.4加試劑
在每孔中依次加入試劑：加入50 μl標準溶液（4.2.3）或試樣提取液（4.5.1）至相應(yīng)微孔中；加入50 μl酶標結(jié)合物（4.2.4）到每個微孔中；再加入50 μl oa抗體（4. 2. 5）到每個微孔中。
4.5.5反應(yīng)
將酶標板輕輕搖晃，使孔中的試劑搖勻，置溫度18℃~30℃培育反應(yīng)10 min。
4.5.6洗滌
將微孔中液體傾倒到水池內(nèi)，倒置微孔支架，在千凈紙巾上輕拍，除去所有殘留的液體，用移液器加蒸餾水250 μl到每個微孔中，洗板，放置2 min，再排空液體，重復(fù)洗滌3次。
4.5.7顯色
加100 μl底物溶液（4.2.9）到每孔中，充分搖勻，置18℃~30℃恒溫箱中，反應(yīng)5 min。
4.5.8 終止
加100 μl終止液（4.2. 10）到每孔中，搖勻。
4.5.9測定
在450 nm處，以空氣為空白調(diào)零，測定吸收值。在60 min內(nèi)讀數(shù)。
4.6結(jié)果計算和表述
4.6.1 限（xian）量法
若試樣孔的吸收值小于標準品孔的吸收值，即a試樣孔<a標準孔，超過限（xian）量值，為陽性。若試樣孔的吸收值大于或等于標準品孔的吸收值，即a試樣孔≥a標準孔，則小于或等于所設(shè)限（xian）量值，為陰性。
限（xian）量值為標準值（μg/l）乘以稀釋因子。按4.5.1操作，稀釋因子為25，若控制標準值為4 μg/l時，試樣中oa的限（xian）量在100 μg/kg。
4.6.2 定量法
百分吸收值：所得的標準或試樣的吸收值除以第一個標準（0標準）的吸收值再乘以100，作為百分吸收值a% ，按式（3）計算。
式中：
a——標準品或試樣的吸收值；
a0——空白的吸收值。
標準曲線的繪制：所計算的百分吸收值對應(yīng)oa濃度（μg/l）的半對數(shù)坐標作標準曲線圖，曲線在1 ng/kg~8 ng/kg范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成線性。根據(jù)試樣的百分吸收值，通過標準曲線，查得相對應(yīng)濃度。試樣中oa的含量（x）以微克每千克（μg/kg）表示，可按式（4）計算。
式中：
c——從標準曲線上查得相對應(yīng)試樣提取液（4.5.1）中oa濃度，單位為微克每升（μg/l）；
v——試樣提取液（4.5.1）體積，單位為毫升（ml）；
n——試樣稀釋倍數(shù)；
m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。
計算結(jié)果表示到小數(shù)點后一位有效數(shù)字。
4.7重復(fù)性
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的相對差值不大于15%。