中華人民共和國國家標準
gb/t 19539-2004
飼料中赭曲霉毒素a的測定
determination of ochratoxin a in feeds
前言
本標準中的薄層色譜方法和酶聯(lián)免疫吸附測定方法主要依據(jù)gb/t 5009.96-2003《谷物和大豆中赭曲霉毒素a的測定》中薄層色譜方法和衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所建立的酶聯(lián)免疫吸附法。本標準規(guī)定以薄層色譜法為仲裁方法,酶聯(lián)免疫吸附測定法為快速篩選法。
本標準由全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會提出。
本標準由全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。
本標準由江蘇省微生物研究所負責(zé)起草。
本標準主要起草人:宓曉黎、袁建興、李利東、丁貴平、成恒嵩。
1范圍
本標準規(guī)定了赭曲霉毒素a(ochratoxin a,以下簡稱oa)的薄層色譜測定方法和酶聯(lián)免疫吸附測定方法。
本標準適用于配合飼料、飼用谷物原料中oa的測定。
薄層色譜測定方法的最(zui)低檢測量為2ng,酶聯(lián)免疫吸附測定方法的最(zui)低檢測量為0.05ng。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標準,然而,鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標準。
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
gb/t 14699.1飼料采樣方法
3薄層色譜法(仲裁法)
3.1 原理
試樣中的oa經(jīng)提取、液-液分配萃取、濃縮,然后進行薄層分離,限(xian)量定量,或用薄層掃描儀測定熒光斑點的熒光強度,外標法定量。
3.2試劑與材料
所用試劑除另有規(guī)定,均使用分析純試劑。水符合gb/t6682中一級水的規(guī)定。
3.2.1石油醚。
3.2.2 甲醇溶液(55+45)。
3.2.3三氯(lv)甲烷。
3.2.4苯-冰乙酸(99+1)。
3.2.5 40g/l氯化鈉溶液。
3.2.6 無水硫酸鈉:650℃灼燒4 h,冷卻后貯于干燥器中備用。
3.2.7展開劑(用時選擇一種):
a)甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(6+3+1.2+0.06);
b)甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6+3+1.4);
c) 苯-冰乙酸(9+1)。
3.2.8 顯色劑:碳酸氫鈉乙醇溶液(在100 ml水中溶解6.0 g碳酸氫鈉,加20 ml乙醇)。
3.2.9薄層板:稱取4g硅膠g,加約10ml 0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液于乳缽中研磨至糊狀。立即倒入涂布器內(nèi)制成10 cm×20 cm、厚度0.3 mm的薄層板,在空氣中干燥后,用甲醇預(yù)展薄層板,除去雜質(zhì),吹干,在105℃~110℃活化1 h,置于干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br>3.2. 10 oa標準儲備溶液:
警告:
1凡接觸oa的容器,需浸入4%次氯酸鈉(naocl)溶液,半天后清洗備用。
2為了安全,分析人員操作時要帶上醫(yī)用乳膠手套。
稱取適量的oa標準品,用苯-冰乙酸(3.2.4)配制成約10μg/ml oa貯備液。貯備液置于4℃冰箱中避光保存。
標定貯備液的濃度,用1 cm石英比色杯,以苯-冰乙酸(3.2.4)為參比,在0a的最大吸收峰波長333 nm處,測定吸光度值a。儲備液中oa的含量(x1)以微克每毫升(μg/ml)表示,按式(1)計算。
式中:
a——測定的吸光度值;
m——oa的摩爾質(zhì)量(m=403 g/mol);
ε——oa在苯冰乙酸中的分子吸收系數(shù)(ε=555 m2/mol);
δ——比色杯的光徑長度,單位為厘米(cm)。
3.2.11 oa標準工作溶液:根據(jù)計算的oa標準儲備液的濃度,精密吸取標準儲備液(3.2.10)適量,用苯稀釋成濃度為1.0 μg/ml的標準工作溶液。
3.3 儀器與設(shè)備
3.3.1小型粉碎機。
3.3.2電動振蕩器。
3.3.3 薄層板涂布器。
3.3.4玻璃器皿:分液漏斗、蒸發(fā)皿、濃縮瓶。所有玻璃器皿均需用稀鹽酸浸泡,依次用自來水、蒸餾水沖洗。
3.3.5 快速定性濾紙。
3.3.6 展開槽:250 mm×150 mm×50 mm(立式,具磨口)。
3.3.7紫外光燈:波長365 nm。
3.3.8點樣器:1 μl~99 μl.
3.3.9薄層掃描儀:配有汞燈光源。
3.4試樣制備
按gb/t 14699.1飼料采樣方法取得試樣,四分法濃縮臧取約200 g,經(jīng)粉碎,混勻,裝入磨口瓶中備用。
3.5 分析步驟
3.5.1試樣處理
稱取約20 g試樣(3.4)(精確至0.01 g),置于200 ml具塞錐形瓶中,加30 ml石油醚和100 ml甲醇溶液(3.2.2),瓶塞蓋緊。振蕩30 min后,通過快速定性濾紙濾入分液漏斗中,待分層后,放出甲醇水層20 ml,置于100 ml分液漏斗中,用ph試紙測試,一般為5~6。加入25 ml三氯(lv)甲烷,振搖2 min,靜置分層后,放出三氯(lv)甲烷層于另一個分液漏斗中,再用10 ml三氯(lv)甲烷重復(fù)振搖提取甲醇水層(在用三氯(lv)甲烷振搖提取時,如發(fā)生乳化現(xiàn)象,可滴加甲醇促使其分層),將三氯(lv)甲烷層合并于同一分液漏斗中,加入50ml~100ml氯化鈉溶液(3.2.5),振搖,放置分層后,將三氯(lv)甲烷層放出,經(jīng)裝有約20 g無水硫酸鈉的玻璃漏斗流入蒸發(fā)皿中,將蒸發(fā)皿置蒸氣浴上通風(fēng)揮干。用約8 ml三氯(lv)甲烷分次將蒸發(fā)皿中的殘渣溶解,轉(zhuǎn)入濃縮瓶中,置60℃水浴減壓濃縮至干,加℃2 ml苯冰乙酸(3.2.4)溶解殘渣,搖勻,供薄層色譜點樣用。
3.5.2 點樣
在距薄層板下端1.5cm~2cm的基線上,以1cm的間距,用點樣器依次點標準工作溶液(3.2.11)2μl、4μl、7μl、10μl(相當(dāng)于2 ng、4 ng、7 ng、10 ng)和試樣液(3.5.1)20μl。
3.5.3 展開
將薄層板放入有展開劑的展開槽中,展至離原點13 cm~15 cm,取出,吹干。
3.5.4 觀察與確證
將展開后的薄層板置于波長365nm紫外光燈下,觀察與oa標準點(4ng)比移值相同處的試樣的藍綠色熒光點。若相同位置上未出現(xiàn)熒光點,則試樣中的oa含量在本測定方法的最(zui)低檢測量100μg/kg以下。如果相同位置上出現(xiàn)熒光點,用顯色劑對準各熒光點進行噴霧后吹干,觀察熒光點由藍綠色變?yōu)樗{紫色且熒光強度明顯加強可確證試樣中含有oa。于熒光點下方用鉛筆標記,待掃描定量測定。
3.5.5 定量測定
3,5.5. 1薄層掃描工作條件
光源:高壓汞燈;
激發(fā)波長:365nm;
發(fā)射波長:450 nm;
檢測方式:反射;
狹縫:可根據(jù)斑點大小進行調(diào)節(jié);
掃描方式:距齒掃描。
3.5.5.2 標準曲線繪制
以oa標準工作溶液質(zhì)量(ng)為橫坐標,以峰面積積分值為縱坐標,繪制標準曲線。
3.6 結(jié)果計算和表述
根據(jù)試樣液熒光斑點峰面積掃描積分值從標準曲線上查出對應(yīng)的oa質(zhì)量(ng),試樣中oa的含量(x)以微克每千克(μg/kg)表示,按式(2)計算。
式中:
v1——試樣液(3.5. 1)最后定容體積,單位為微升(μl);
v2——試樣液點樣體積,單位為微升(μl);
m1——從標準曲線上查得試樣液點上對應(yīng)的oa的質(zhì)量,單位為納克(ng);
m0——最后提取液相當(dāng)試樣的質(zhì)量,單位為克(g)。
計算結(jié)果表示到小數(shù)點后一位有效數(shù)字。
3.71復(fù)性
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的相對差值不大于10%。
4酶聯(lián)免疫吸附測定法(怏速篩選法)
4.1原理
方法的檢測依據(jù)是抗原抗體反應(yīng)。將oa抗體的羊抗體吸附在固相載體表面,加入oa抗體、酶標oa結(jié)合物、oa標準或試樣液,在oa抗體與固相載體表面羊抗體結(jié)合的同時,游離的oa、酶標oa結(jié)合物與結(jié)合在固體表面oa抗體競爭,未結(jié)合的酶標oa結(jié)合物洗滌除去。加入酶底物,在結(jié)合酶的催化作用下,無色底物降解產(chǎn)生有藍色物質(zhì)。加入終止劑后顏色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。通過酶標檢測儀,在450nm波長處測吸收值。吸光強度與試樣中oa的濃度成反比。
酶聯(lián)免疫吸附測定法具有操作簡單,快速靈敏,結(jié)果可靠的特點。目前有專門測定oa的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的商品。在分析時適當(dāng)參考操作說明書。
4.2試劑與材料
4.2.1 包被抗體的聚苯乙烯微量反應(yīng)板24孔或48孔。
4.2.2 70% 甲醇溶液。
4.2.3 oa標準溶液:精密吸取標定后的標準儲備液(3.2.10)適量,用甲醇溶液(4.2.2)配制成oa標準溶液1~5,濃度分別為0 μg/l、1 μg/l、2 μg/l、4 μg/l、8 μg/l。
4.2.4 酶標抗原溶液:oa與辣根過氧化酶結(jié)合物。
4.2.5抗體溶液:oa抗體。
4.2.6檸檬酸緩沖溶液[c(na3c6h5o7)=0.1 mol/l,ph=4.0]:稱取10.147 1 g檸檬酸鈉(na3c6h5o7·2h2o),13. 764 2 g檸檬酸(c6h8o7•h2o)加水溶解至1 l。
4.2.7底物溶液甲:四甲基聯(lián)苯胺,用檸檬酸緩沖溶液(4.2.6)配成濃度為0.4g/l。
4.2.8底物溶液乙:取 1.5 ml 30%過氧化氫,用檸檬酸緩沖溶液(4.2.6)稀釋至1 l。
4.2.9底物溶液:底物溶液甲與底物溶液乙1 : 1的混合液。
4.2.10終止液:硫酸溶液(1+17)。
4.3儀器與設(shè)備
4.3.1酶標測定儀:帶 450 nm波長。
4.3.2小型粉碎機。
4.3.3 50μl、100μl、1000μl微量移液器。
4.3.4電動振蕩器。
4.3.5 玻璃器皿:50 ml錐形瓶、漏斗、量筒。
4.3.6快速濾紙。
4.4試樣制備
同3.4。
4.5分析步驟
4.5.1試樣處理
稱取約5 g試樣(4.4)(精確至0.01 g),置于50 ml具塞錐形瓶中,加入12.5 ml甲醇溶液(4.2.2),密塞。振蕩器(4.3.4)提取5 min。提取液通過快速濾紙過濾,敢1 ml濾液,加9 ml蒸餾水稀釋,搖勻,為試樣液。
4.5.2分析前注意事項
分析前將所有試劑平衡至室溫;分析后立即將所有試劑放回2℃~8℃冰箱;在所有培育中,避光,蓋上微孔板蓋。
4.5.3定位
根據(jù)需要設(shè)定限(xian)量法(如表1)和定量法(如表2)。取足夠數(shù)量的微孔置微孔架上,標準品和試樣做兩個平等實驗,記錄標準品孔和試樣孔的位置。限(xian)量法時控制標準品孔號中的濃度為限(xian)量值/稀釋因子,并通過調(diào)節(jié)稀釋因子使之濃度在0 μg/l~8 μg/l范圍內(nèi)。
4.5.4加試劑
在每孔中依次加入試劑:加入50 μl標準溶液(4.2.3)或試樣提取液(4.5.1)至相應(yīng)微孔中;加入50 μl酶標結(jié)合物(4.2.4)到每個微孔中;再加入50 μl oa抗體(4. 2. 5)到每個微孔中。
4.5.5反應(yīng)
將酶標板輕輕搖晃,使孔中的試劑搖勻,置溫度18℃~30℃培育反應(yīng)10 min。
4.5.6洗滌
將微孔中液體傾倒到水池內(nèi),倒置微孔支架,在千凈紙巾上輕拍,除去所有殘留的液體,用移液器加蒸餾水250 μl到每個微孔中,洗板,放置2 min,再排空液體,重復(fù)洗滌3次。
4.5.7顯色
加100 μl底物溶液(4.2.9)到每孔中,充分搖勻,置18℃~30℃恒溫箱中,反應(yīng)5 min。
4.5.8 終止
加100 μl終止液(4.2. 10)到每孔中,搖勻。
4.5.9測定
在450 nm處,以空氣為空白調(diào)零,測定吸收值。在60 min內(nèi)讀數(shù)。
4.6結(jié)果計算和表述
4.6.1 限(xian)量法
若試樣孔的吸收值小于標準品孔的吸收值,即a試樣孔<a標準孔,超過限(xian)量值,為陽性。若試樣孔的吸收值大于或等于標準品孔的吸收值,即a試樣孔≥a標準孔,則小于或等于所設(shè)限(xian)量值,為陰性。
限(xian)量值為標準值(μg/l)乘以稀釋因子。按4.5.1操作,稀釋因子為25,若控制標準值為4 μg/l時,試樣中oa的限(xian)量在100 μg/kg。
4.6.2 定量法
百分吸收值:所得的標準或試樣的吸收值除以第一個標準(0標準)的吸收值再乘以100,作為百分吸收值a% ,按式(3)計算。
式中:
a——標準品或試樣的吸收值;
a0——空白的吸收值。
標準曲線的繪制:所計算的百分吸收值對應(yīng)oa濃度(μg/l)的半對數(shù)坐標作標準曲線圖,曲線在1 ng/kg~8 ng/kg范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成線性。根據(jù)試樣的百分吸收值,通過標準曲線,查得相對應(yīng)濃度。試樣中oa的含量(x)以微克每千克(μg/kg)表示,可按式(4)計算。
式中:
c——從標準曲線上查得相對應(yīng)試樣提取液(4.5.1)中oa濃度,單位為微克每升(μg/l);
v——試樣提取液(4.5.1)體積,單位為毫升(ml);
n——試樣稀釋倍數(shù);
m——試樣質(zhì)量,單位為克(g)。
計算結(jié)果表示到小數(shù)點后一位有效數(shù)字。
4.7重復(fù)性
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的相對差值不大于15%。