mef細(xì)胞鋪制：
在t25培養(yǎng)瓶中加入0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱至少放置15 min以上。 吸除0.2%明膠，加入事先水浴加熱至37℃的mef*培養(yǎng)液。一般地，一個(gè)t25培養(yǎng)瓶中加入5 ml mef*培養(yǎng)液。 按實(shí)驗(yàn)需要：小鼠胚胎干細(xì)胞使用km-r p3 mef或cf-1 p3 mef；小鼠ips使用icr-r p3 mef，復(fù)蘇mef細(xì)胞若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含2 ml mef*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的mef*培養(yǎng)液1 ml，重懸后按照一個(gè)t25培養(yǎng)瓶鋪1´106的mef細(xì)胞，平均加入到t25培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。24 h以后可以傳入小鼠胚胎干細(xì)胞或小鼠ips細(xì)胞。 復(fù)蘇或傳代小鼠胚胎干細(xì)胞或小鼠ips細(xì)胞前，將t25培養(yǎng)瓶中的mef*培養(yǎng)液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞*培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞*培養(yǎng)液待用。復(fù)蘇：
將小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心5 min。 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞*培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮。 重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。 轉(zhuǎn)移至1個(gè)已經(jīng)鋪好mef細(xì)胞的t25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞*培養(yǎng)液。傳代：
一般在復(fù)蘇后第2-3天傳代，視克隆大小和密度而定。 吸除廢液。 用pbs（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。 加入1.0 ml的0.25%胰酶（含edta）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。 加2 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞*培養(yǎng)液終止消化。 多次輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞*培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到鋪好mef細(xì)胞的t25培養(yǎng)瓶中。一般地，一個(gè)t25培養(yǎng)瓶加入5-6 ml培養(yǎng)液。 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 每天換液。傳代比例：1:4-1:7
凍存： 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái)，制成細(xì)胞懸液。 以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。 按每支存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)入液氮。凍存液配方：小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液或小鼠ips*培養(yǎng)液60%，es級(jí)fbs 30%，dmso 10%
附：小鼠胚胎干細(xì)胞與mef細(xì)胞分離的簡(jiǎn)易方法（差速貼壁法）： 培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細(xì)胞，按傳代的操作方法將細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到無(wú)mef細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地，一個(gè)t25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞，在一個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細(xì)胞貼壁速度過(guò)快無(wú)法有效分離小鼠胚胎干細(xì)胞與mef細(xì)胞）中。 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于37°c培養(yǎng)箱內(nèi)靜置1小時(shí)。 1小時(shí)后，絕大部分mef細(xì)胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細(xì)胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。 收取培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
小鼠胚胎干細(xì)胞（mes細(xì)胞）、小鼠ips無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)protocol
復(fù)蘇： 在t25培養(yǎng)瓶中加入0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱至少放置15 min以上。 吸除0.2%明膠，加入事先水浴加熱至37℃的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞培養(yǎng)液5 ml。 將小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心5 min。 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮。 重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。 轉(zhuǎn)移至1個(gè)已經(jīng)包被過(guò)明膠的t25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞培養(yǎng)液。傳代：
一般在復(fù)蘇后第2-3天傳代，視克隆大小和密度而定。 吸除廢液。 用pbs（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。 加入1.0 ml的0.25%胰酶（含edta）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。 加2 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。 多次輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠ips細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到預(yù)先包被過(guò)0.2%明膠的t25培養(yǎng)瓶中。一般地，一個(gè)t25培養(yǎng)瓶中加入5-6 ml培養(yǎng)液。 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 每天換液。傳代比例：1:4-1:7
凍存：
按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái)，制成細(xì)胞懸液。 以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。 按每支存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)入液氮。凍存液配方：小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠ips培養(yǎng)液80%，es級(jí)fbs 10%，dmso 10%