環(huán)狀(circrna)是一類特殊的共價(jià)閉環(huán)rna分子，在調(diào)控生理和病理進(jìn)程中，通過不同的機(jī)理發(fā)揮著重要作用。傳統(tǒng)上，circrna被認(rèn)為是一種非編碼rna(ncrna)。2014年，在北卡羅來納大學(xué)報(bào)導(dǎo)了環(huán)形rna在細(xì)胞內(nèi)可通過非帽依賴的機(jī)理來翻譯蛋白，人們認(rèn)識到circrna也具有編碼與表達(dá)蛋白的能力。此后，隨著體外環(huán)化技術(shù)的發(fā)展，比線性mrna穩(wěn)定性更強(qiáng)的合成circrna成為mrna治療領(lǐng)域備受關(guān)注的新技術(shù)，有望以mrna藥物相似的遞送方法，實(shí)現(xiàn)疾病的治療。
圖1環(huán)狀rna結(jié)構(gòu)
一、circrna的特點(diǎn)
1、強(qiáng)穩(wěn)定性：與線性rna相比，circrna的主要優(yōu)勢就是其環(huán)狀結(jié)構(gòu)提高了穩(wěn)定性。因?yàn)閏ircrna中5’和3’末端的缺失使其具有外切酶抗性，不能通過典型的rna降解途徑降解，需要通過核酸內(nèi)切酶線性化后將其降解（圖2，a-c），因此，具有更高的體內(nèi)穩(wěn)定性，半衰期更長。
圖2 circrna的降解和翻譯
2、非帽依賴性翻譯：大多數(shù)真核生物mrna的翻譯起始于5’端，以典型的帽(7gpppn)依賴方式進(jìn)行（圖2，d），由于步驟復(fù)雜且需要招募較多起始因子，該過程具有高能量消耗的特點(diǎn)，因此，當(dāng)機(jī)體處于病毒感染或疾病等細(xì)胞應(yīng)激的不利條件下，該典型翻譯起始將被整體抑制，以確保細(xì)胞響應(yīng)應(yīng)激并存活。那么當(dāng)?shù)湫头g機(jī)制下調(diào)時(shí)，維持細(xì)胞生存所需要的關(guān)鍵蛋白的產(chǎn)生就需要另一套非典型翻譯機(jī)制，即非帽依賴性翻譯—通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)來驅(qū)動(dòng)，而這種非帽機(jī)制正適合無5’端的circrna，已知ires是circrna主要的翻譯方式。換言之，在疾病治療過程中，當(dāng)機(jī)體處于er應(yīng)激、遺傳毒性應(yīng)激、缺氧、營養(yǎng)剝奪、體溫過低、體溫過高或感染狀態(tài)下，帽依賴性翻譯起始被抑制，線性mrna無法有效翻譯，基于mrna的藥物療效降低，而circrna可憑借非帽依賴性翻譯的機(jī)制優(yōu)勢，保證蛋白質(zhì)的正常翻譯，保證藥物療效。
3、多順反子表達(dá)：多順反子表達(dá)是指從單個(gè)mrna分子中翻譯兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的基因。對于多順反子線性mrna，5’cap比ires的表達(dá)更高，導(dǎo)致蛋白表達(dá)比例不均。而對于circrna，通過引入多個(gè)ires-orf，有可能達(dá)到接近化學(xué)計(jì)量的多順反子表達(dá)，因?yàn)樗芯幋a的蛋白質(zhì)都具有相同的翻譯起始機(jī)制。雖然這一點(diǎn)尚未得到證實(shí)，但circrna的多順反子表達(dá)可能有益于多組分蛋白質(zhì)療法，其中蛋白質(zhì)復(fù)合物組分的受控比例至關(guān)重要。
4、免疫原性低：線性rna通過病原體識別受體（如rig-i、tlr3、tlr7、tlr8等）刺激先天免疫，導(dǎo)致干擾素反應(yīng)，進(jìn)而對其翻譯及應(yīng)用造成了負(fù)面影響；而純的circrna并不存在rig-i、tlr3、 tlr7及tlr8的識別序列，這種“免疫沉默(immunosilent)”可以使其更有效地表達(dá)蛋白質(zhì)，而沒有抑制性干擾素反應(yīng)。此外，先天免疫系統(tǒng)激活減少限制了樹突狀細(xì)胞的活化和成熟，有助于防止對編碼的治療蛋白產(chǎn)生免疫力。
二、circrna的應(yīng)用
1、蛋白質(zhì)替代療法
蛋白質(zhì)替代療法的目的是恢復(fù)那些缺失或有缺陷的蛋白質(zhì)功能，通常是由基因突變導(dǎo)致。采用mrna治療內(nèi)源蛋白缺失已應(yīng)用于多種疾病
相對于mrna，circrna在蛋白替代療法的應(yīng)用中具有諸多優(yōu)勢，如結(jié)構(gòu)具有更高的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)間更長；具有與線性rna相似的蛋白表達(dá)峰值，但下降率較低。這些優(yōu)勢使得circrna可以產(chǎn)生較高的蛋白質(zhì)累積并持續(xù)較長時(shí)間；減少給藥頻率，且免疫原性較低。
2、疫苗
mrna疫苗具有高效、研發(fā)周期短、模塊化生產(chǎn)、低成本等優(yōu)勢，已是通用的疫苗種類，尤其在應(yīng)對新冠等突發(fā)流行病，其極快的研發(fā)制造能力，優(yōu)勢極為顯著。同時(shí)，在面對病毒變異方面，多價(jià)mrna疫苗的易得性可及時(shí)提供針對多種病原體的保護(hù)，意義重大。
另外，mrna疫苗的自佐劑效應(yīng)也為疫苗保護(hù)性免疫的誘導(dǎo)提供了支持。在機(jī)制上，mrna會(huì)引起與病毒免疫相關(guān)的th1偏向免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)對t細(xì)胞擴(kuò)增和免疫記憶形成至關(guān)重要的i型干擾素反應(yīng)，對病毒預(yù)防極有幫助。不過該機(jī)制同時(shí)也限制了mrna的帽依賴性翻譯起始，影響表達(dá)效率。那么circrna所使用的非帽依賴性起始機(jī)制，例如不受干擾素抑制的ires，是一種有吸引力的替代方案。在保持circrna抗原表達(dá)穩(wěn)定的同時(shí)，更有效地誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)，可能會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的保護(hù)作用。
疫苗接種的目標(biāo)是誘導(dǎo)強(qiáng)烈的適應(yīng)性免疫反應(yīng)和長期免疫記憶。適應(yīng)性免疫記憶的誘導(dǎo)部分取決于抗原暴露的持續(xù)時(shí)間。因此，rna編碼抗原的長期表達(dá)可以更有效地引發(fā)具有持久免疫記憶的免疫反應(yīng) 。與mrna相比，circrna固有的穩(wěn)定性延長了蛋白質(zhì)翻譯的時(shí)間，增加了體內(nèi)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，長期表達(dá)抗原可以更有效地誘導(dǎo)具有持久免疫記憶的免疫反應(yīng)。
3、癌癥免疫療法
癌癥免疫治療采用機(jī)體免疫的作用成分如細(xì)胞因子、抗體和免疫細(xì)胞等進(jìn)行癌癥的治療。基于rna的免疫治療可以通過將癌癥新抗原編碼為疫苗、免疫刺激細(xì)胞因子、抗體和免疫細(xì)胞受體實(shí)現(xiàn)，具有靈活性及多功能性。此外，還可以通過非病毒載體以mrna直接轉(zhuǎn)染t細(xì)胞，在體原位生產(chǎn)car-t細(xì)胞，避免了傳統(tǒng)car-t細(xì)胞制造的缺點(diǎn)。
circrna在癌癥免疫治療中有幾個(gè)優(yōu)勢：
1）與mrna相同，circrna既可應(yīng)用于腫瘤個(gè)性化治療，也可同時(shí)編碼多種新抗原，降低癌癥逃逸和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。對于精準(zhǔn)細(xì)胞治療，可以通過改變編碼序列輕松定制嵌合抗原受體的circrna編碼，并定制以靶向不同類型的癌癥進(jìn)行精準(zhǔn)癌癥免疫治療；
2）circrna的穩(wěn)定性強(qiáng)，可以保證抗原蛋白的穩(wěn)定表達(dá)；circrna癌癥疫苗可以延長抗原呈遞，獲得更強(qiáng)的免疫反應(yīng)；增加免疫刺激蛋白，如細(xì)胞因子和小抗體片段的表達(dá)時(shí)間，可以更好地將免疫細(xì)胞招募到腫瘤部位；
3）早期研究表明，修飾mrna的低免疫原性對腫瘤中的蛋白質(zhì)表達(dá)很重要，因此circrna固有的較低免疫原性對于腫瘤內(nèi)免疫刺激蛋白表達(dá)更具優(yōu)勢。未修飾的rna激活先天免疫系統(tǒng)將降低抗體表達(dá)，阻止適應(yīng)性免疫細(xì)胞有效募集到腫瘤中；
4）由于ires啟動(dòng)的非帽依賴性翻譯既可適應(yīng)各種復(fù)雜的腫瘤環(huán)境，也可抵抗癌細(xì)胞減緩蛋白翻譯并逃逸細(xì)胞因子或抗體免疫治療機(jī)制，增加了不同癌癥治療的一致性。
4、基因編輯
在基因編輯方面，基于circrna的穩(wěn)定性，首先可應(yīng)用于小的rna組分，比如向?qū)na(adrna/grna)，因?yàn)樵诨蚓庉嬒到y(tǒng)中的向?qū)na是最脆弱的，很容易被核酸酶降解；其次，circrna也有望用于編碼基于蛋白質(zhì)的編輯器以進(jìn)行基因編輯。與mrna相比，circrna提供的穩(wěn)定性和穩(wěn)健表達(dá)可以使cas9蛋白的持久性更長，增加的蛋白表達(dá)可能會(huì)顯著提高基因編輯效率。
在adars介導(dǎo)的rna編輯中，2019年，北京大學(xué)魏文勝課題組曾研發(fā)出了借助grna募集adar實(shí)現(xiàn)rna精準(zhǔn)編輯的新策略[1]：leaper™。leaper™通過在細(xì)胞中表達(dá)短工程化的adar募集rna(adar-recruiting rna，arrna)來完成adar的招募以及rna編輯，由于這種技術(shù)彼時(shí)尚不成熟，具有一定長度的arrna可能引起鄰近的堿基的脫靶編輯。2022年，魏文勝課題組推出了leaper™的升級版本—— leaper™ 2.0，設(shè)計(jì)并運(yùn)用了可招募adar的環(huán)形rna(circular arar-recruiting rna，circ-arrna)[2]，通過aav遞送，遺傳編碼的circ-arrna可以在人的原代細(xì)胞和類器官中實(shí)現(xiàn)長時(shí)程的rna編輯，這種可避免核酸外切酶切割的環(huán)狀rna進(jìn)一步提升了體外和體內(nèi)編輯的效率和精準(zhǔn)性，基本清除了雙鏈rna區(qū)域內(nèi)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本上的脫靶。
5、非編碼環(huán)狀rna治療
circrna在細(xì)胞內(nèi)具有內(nèi)源性非編碼功能，如mirna和rna結(jié)合蛋白海綿功能。circrna作為調(diào)控rna，具有作為mirna和rna結(jié)合蛋白的競爭性抑制劑從而進(jìn)行治療的潛力。不過目前已有研究都處于體外實(shí)驗(yàn)階段，尚未有體內(nèi)數(shù)據(jù)，不過受限于遞送問題，體內(nèi)模型可能也難以實(shí)現(xiàn)。
circrna是共價(jià)封閉的、高度穩(wěn)定的rna形式，具有巨大的治療應(yīng)用潛力。與線性蛋白相比，circrna具有穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)的能力等優(yōu)點(diǎn)，在疫苗開發(fā)、癌癥免疫治療、蛋白質(zhì)替代治療和基因編輯方面有著廣闊的可應(yīng)用空間?？傊甤ircrna在基于rna的藥物領(lǐng)域是一種有潛力的rna形式，有望更新個(gè)性化治療手段。
參考文獻(xiàn)
[1]yi, z., zhu, s., et al. (2019). programmable rna editing by recruiting endogenous adar using engineered rnas. nature biotechnology, 37(9), 1059–1069.
[2] yi, z., qu, l., tang, h. et al. engineered circular adar-recruiting rnas increase the efficiency and fidelity of rna editing in vitro and in vivo. nat biotechnol 40, 946–955 (2022).
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環(huán)狀rna定制流程：
環(huán)狀rna定制化合成/定制化服務(wù)
服務(wù)參數(shù)：
1、min合成量：200ug/條；
2、標(biāo)準(zhǔn)ires：abs-ires-g；
3、min合成序列條數(shù)：1條（定制化合成）；不低于3條（定制化服務(wù)）；
4、標(biāo)準(zhǔn)交付：1.0ug/ul；
5、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控：濃度；純度；
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