大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)。獲得感受態(tài)細(xì)胞；制備含有目的片段的陽(yáng)性克隆。
二、實(shí)驗(yàn)原理
轉(zhuǎn)化(transformation)是將外源dna分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(rˉ，mˉ)，它可以容忍外源dna分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如電擊法，cacl2，rbcl(kcl)等化學(xué)試劑法的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源dna分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的dna分子通過(guò)復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(transformant，即帶有異源dna分子的受體細(xì)胞)。cacl2 法簡(jiǎn)便易行，且其轉(zhuǎn)化效率全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15％的無(wú)菌甘油于-70℃保存(半年)，因此cacl2法使用更廣泛。
轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：
統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)化子數(shù)，轉(zhuǎn)化后在抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子。
轉(zhuǎn)化子總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積 / 涂板菌液體積）
轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)/每μg質(zhì)粒dna）= 對(duì)照2轉(zhuǎn)化子總數(shù) / 質(zhì)粒dna加入量（μg）
感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)= 對(duì)照1菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)
感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率= 轉(zhuǎn)化子總數(shù) / 感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)
為了提高轉(zhuǎn)化效率，實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：
1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的od600 來(lái)控制。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。
2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒dna應(yīng)主要是超螺旋態(tài)dna(cccdna)。轉(zhuǎn)化效率與外源dna的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源dna的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccdna即可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，dna溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。
3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑，如cacl2 等均需是最高純度的(gr.或ar.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。
4. 防止雜菌和雜dna的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、dna酶或雜dna所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜dna的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。
本實(shí)驗(yàn)以e.coli top-10菌株為受體細(xì)胞，并用cacl2處理，使其處于感受態(tài)，然后與puc質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于puc質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(ampr)，可通過(guò)amp抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)入puc，則在含amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）已導(dǎo)入了puc。
三、主要試劑
e.coli(top-10, dh 5a)、cacl2、無(wú)菌水、胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂、氨芐青霉素。
四、儀器耗材
控溫?fù)u床(37℃)、冷凍離心機(jī)（50ml轉(zhuǎn)子）、水浴鍋、冰箱（-20℃，-70℃）、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱(37℃)、分光光度計(jì)、移液器、槍頭、離心管、小三角瓶、6cm平皿、酒精燈、三角玻棒、酒精棉球、火柴
五、實(shí)驗(yàn)步驟
感受態(tài)細(xì)胞制備：
1. 第一天：從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落接于2 ml lb液體培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
2. 第二天：取0.5 ml菌液轉(zhuǎn)接到一個(gè)含有50 ml lb液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)。2-3 h，測(cè)定od600 ≤ 0.4-0.5，細(xì)胞數(shù)務(wù)必 ≤108／ml。（此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵)
3. 將菌液轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中，冰上放置10 min。
4. 離心10 min，4000r/min，4℃，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡，回收細(xì)胞。
5. 用冰冷的0.1 mol/l cacl210 ml懸浮沉淀，立即放在冰上30 min。
6. 4℃ 6000 r/min，離心10 min，回收細(xì)胞。
7. 用冰冷的0.1mol/l cacl22 ml懸浮細(xì)胞，務(wù)必放在冰上。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。
8. 分裝，每管200 μl。可以加入15%甘油-70度保存。
轉(zhuǎn)化：
9. 取200 μl新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入連接產(chǎn)物10μl（~50 ng ）混勻冰上放置30 min。
同時(shí)作2個(gè)對(duì)照管：
對(duì)照1：200 μl感受態(tài)細(xì)胞＋ 10μl無(wú)菌水（不含氨芐皿）每班做一個(gè)
對(duì)照2：200 μl 感受態(tài)細(xì)胞＋ 1μl 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒dna溶液（10ng/μl）每班做1-3個(gè)
10. 將管放到42℃循環(huán)水浴90-120sec。
11. 冰浴2 min。（提前準(zhǔn)備好）
12. 每管加600 μl lb液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1 h（慢搖）。
13. 將適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，離心后涂在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中。（提前倒好平板）
注意：對(duì)照1涂不加氨芐的平皿，菌液不離心，取1-10μl涂；
對(duì)照2涂氨芐平皿，菌液不離心，取5-20μl涂。
14. 倒置平皿37℃培養(yǎng)12-16 h，出現(xiàn)菌落。
15. 計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照的轉(zhuǎn)化頻率。
16. 記錄樣品的轉(zhuǎn)化子總數(shù)。
六、注意事項(xiàng)
1. 無(wú)菌操作。
2. 低溫操作。
3．注意加amp時(shí)的溫度，溫度不能過(guò)高（55-60度），否則抗生素失活，會(huì)使克隆株無(wú)法篩選出來(lái)。
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