通用名稱:豬鏈球菌(2型)檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光pcr法)
英文名稱:streptococcus suis serotype 2 detecting kit (real-time pcr method)
【包裝規(guī)格】25t/盒& 50t/盒
【預(yù)期用途】
豬鏈球菌病是由豬鏈球菌(streptococcus suis)引起的一種人畜共患的傳染病。豬鏈球菌根據(jù)莢膜抗原可分為35個(gè)血清型,其中2型豬鏈球菌是重要的人畜共患病的病原,可感染人引起腦膜炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥及突發(fā)性死亡。該病多發(fā)于與生豬或豬肉產(chǎn)品接觸的從業(yè)人群。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光pcr原理,依據(jù)豬鏈球菌*基因定性篩查檢測(cè)豬鏈球菌,對(duì)2型豬鏈球菌引起的相關(guān)病癥的診斷及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)2型豬鏈球菌基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含有2型豬鏈球菌dna模板的情況下,利用儀器對(duì)pcr過程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
序號(hào)
組成
25t/盒
50t/盒
1
ss2pcr反應(yīng)液
437.5μl×1管
875μl×1管
2
ss2混合酶液
62.5μl×1管
125μl×1管
3
ss2陰性對(duì)照
40μl×1管
40 μl×1管
4
ss2陽(yáng)性對(duì)照
40μl×1管
40 μl×1管
5
說明書
1份
1份
注:陰性對(duì)照為不含2型豬鏈球菌的其它菌的混合物,陽(yáng)性對(duì)照為滅活的2型豬鏈球菌。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。
【適用儀器】abi系列、bio-rad系列、agilent stratagene mx系列、roche lightcycler r480、cepheid smartcycler、rotor-gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀。
【樣本要求】
1.如使用原始標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),標(biāo)本應(yīng)為新鮮采集并使用雙蒸滅菌水或滅菌生理鹽水懸浮的原始標(biāo)本。
2.如需在增菌后進(jìn)行pcr檢測(cè),則應(yīng)使用選擇性增菌液對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行增菌。
3.標(biāo)本收集后若不能立即檢測(cè),可置于2~8℃冷藏過夜保存;如需長(zhǎng)期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃~-80℃。
【檢驗(yàn)方法】
1.試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))
(1)從冰箱中取出試劑盒,從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
(2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對(duì)照數(shù)(1t)+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)(1t)+誤差預(yù)留量(1t)+樣本數(shù)
單反液配制表(每份)
pcr反應(yīng)液
17.5 μl
混合酶液(taq酶+ung酶)
2.5 μl
(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μl/管分裝量將試劑分裝至pcr反應(yīng)管。
(4)蓋緊pcr反應(yīng)管蓋后將pcr反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。 剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))
用qiagen、roche公司dna提取試劑盒提取dna,具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的pcr反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本dna各5μl、終體積25μl/管,蓋好pcr反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到pcr儀器上。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5μl試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品,終體積為25μl/管,蓋好pcr反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到pcr儀器上。
4.pcr(pcr擴(kuò)增區(qū))
(1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的pcr反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。
(2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。
反應(yīng)體積
25 μl
通道選擇
fam通道采集2型豬鏈球菌熒光信號(hào)
pcr
反應(yīng)
條件
步驟
條件
循環(huán)數(shù)
ung處理
50℃:2分鐘(min)
1
預(yù)變性
95℃:3分鐘(min)
1
預(yù)擴(kuò)增
95℃:5秒(s)
5
55℃:40秒(s)
pcr擴(kuò)增
95℃:5秒(s)
40
55℃:40秒(s)
(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào))
注:abi系列熒光pcr儀在設(shè)置時(shí)不選rox校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇none。
【參考值(參考范圍)】
1.試劑盒有效性判定:
(1)陽(yáng)性對(duì)照:有典型s型擴(kuò)增曲線或ct值≤35。
(2)陰性對(duì)照:ct值>38或無(wú)ct值,線形為直線或輕微斜線,無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定:
(1)陽(yáng)性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。
(2)可疑:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果ct值在35~38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,則判定為陽(yáng)性,否則為陰性。
(3)陰性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果ct值>38或無(wú)ct值。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
通道及檢測(cè)結(jié)果
標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋
fam
陰性(-)
標(biāo)本中未檢出2型豬鏈球菌
陽(yáng)性(+)
標(biāo)本中檢測(cè)出2型豬鏈球菌
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1.當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最di檢出*可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2.本試劑盒僅供標(biāo)本初步篩查使用,對(duì)于本試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步使用培養(yǎng)法進(jìn)行確診。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】產(chǎn)品的最di檢出限為102cfu,產(chǎn)品cv值≤5%。
【注意事項(xiàng)】
1.整個(gè)檢測(cè)過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和pcr擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作,各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用,不能混用;實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作;三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。
2.每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照。
3.為保證試劑不受標(biāo)本污染,必須將混合酶液及pcr反應(yīng)液保存于試劑準(zhǔn)備區(qū)。
4.試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時(shí)離心。
5.試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),并單獨(dú)存放。
6.為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸pcr反應(yīng)管,并應(yīng)避免在pcr反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。
7.儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置;不同批號(hào)試劑不能混用。
8.abi系列熒光定量pcr儀參數(shù)設(shè)置中不選rox校正,淬滅基因選擇none。
9.實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。
關(guān)鍵詞:濾芯吸頭 生物安全柜 安全柜