檢測原理
試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)。往預先包被人熱休克蛋白90α(hsp-90α)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、hrp標記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物tmb顯色,tmb在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人熱休克蛋白90α(hsp-90α)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(od 值),計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿:edta、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。
3. 細胞上清液:3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
酶標儀(450nm)高精度加樣器及槍頭:0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul37℃恒溫箱操作注意事項
試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡60分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶,這屬于正常現(xiàn)象,水浴加熱使結晶*溶解后再使用。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。預處理后的樣本無需稀釋,直接取10μl加樣即可。嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。所有液體組分使用前充分搖勻。試劑盒組成
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
微孔酶標板
12孔×8條
12孔×4條
無
標準品
0.3ml
0.3ml
無
*
6ml
3ml
無
檢測抗體-hrp
10ml
5ml
無
20×洗滌緩沖液
25ml
15ml
按說明書進行稀釋
底物a
6ml
3ml
無
底物b
6ml
3ml
無
終止液
6ml
3ml
無
封板膜
2張
2張
無
說明書
1份
1份
無
自封袋
1個
1個
無
注:標準品濃度依次為:400、200、100、50、25、0ng/ml.
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。自動洗板機:每孔注入洗液350μl,浸泡1min,洗板5次。操作步驟
從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μl;待測樣本孔先加待測樣本10μl,再加*40μl;隨后標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(hrp)標記的檢測抗體100μl,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。每孔加入底物a、b各50μl,37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μl,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的od值。結果判斷
繪制標準曲線:在excel工作表中,以標準品濃度作橫坐標,對應od值作縱坐標,繪制出標準品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本濃度值。
試劑盒性能
準確性:標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)r值,大于等于0.9900。靈敏度:低檢測濃度小于1.0ng/ml。特異性:不與其它可溶性結構類似物交叉反應。重復性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10%、板間變異系數(shù)小于15%。貯藏:2-8℃,避光防潮保存。有效期:6個月免責聲明
試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實驗或人體實驗,否則所產(chǎn)生的一切后果,由實驗者承擔,本公司概不負責。嚴格按照說明書操作,實驗者違反說明書操作,后果由實驗者承擔。