動(dòng)物支氣管炎病毒(aibv)核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>檢測(cè)動(dòng)物體液、腎臟、淋巴結(jié)、咽、泄殖腔試子、肺臟等組織標(biāo)本以及細(xì)胞培養(yǎng)液中傳染性支氣管炎病毒(aibv)rna，適用于傳染性支氣管炎病毒(aibv)感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查，其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。
實(shí)驗(yàn)原理：
選取一對(duì)支氣管炎病毒(aibv)特異性引物和一條特異性熒光探針，應(yīng)用trizol提取rna，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用將rna轉(zhuǎn)錄成cdna，后者在taq酶作用下，配以fq-buffer(內(nèi)含mg2+、tris-hcl等)、四種核苷酸單體（dntps）等成分，用一步pcr熒光探針?lè)▽?duì)禽傳染性支氣管炎病毒(aibv) rna進(jìn)行擴(kuò)增，從而達(dá)到快速檢測(cè)之目的。
標(biāo)本采集：
1）：咽及泄殖腔等試子標(biāo)本采集：用棉試子取咽或泄殖腔分泌物，將試子放入盛有1.0ml pbs(或生理鹽水)的離心管中，立即送檢。
2）：組織標(biāo)本采集：取動(dòng)物肺、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)及胰腺等組織約1g，置入1.5ml潔凈ep管，立即送檢。
3）：體液及培養(yǎng)液體標(biāo)本采集：取上述標(biāo)本約1ml，置入1.5ml潔凈ep管，立即送檢。
實(shí)驗(yàn)方法：
1）：樣品處理：
培養(yǎng)物、試子等液體標(biāo)本：將標(biāo)本充分混勻，取100μ液體標(biāo)本加入500μl rna提取液a（trizol reagents）充分震蕩，室溫放置5min。
固體組織：取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入500μl rna提取液a（trizol reagents），研磨或振蕩至勻漿狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml的ep管中，室溫放置5min。
2）：加入100μl氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min，4℃ 13,000rpm離心5min。
3）：小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加300 μl 無(wú)水乙醇，另加10μl rna提取液b（內(nèi)含不溶物，使用前室溫溶解并充分混勻），充分混勻，13,000rpm離心1min。
4）：.棄上清，加入500μl 75%的depc乙醇，充分混勻，13,000rpm離心1min，小心吸去大部分乙醇。
5）：.將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈，用20µl depc h2o溶解沉淀。
陰性質(zhì)控品：取100μl陰性質(zhì)控品加入500μl rna提取液a（trizol reagents）充分震蕩，室溫放置5min。后按1.2~1.5操作。