crispr-cas9是一種常用的基因編輯技術(shù)，可以用來(lái)改造細(xì)胞。被改造的細(xì)胞有希望應(yīng)用于各類疾病的治療。細(xì)胞治療項(xiàng)目需要通過(guò)支原體檢測(cè)，才有可能被用于臨床。德國(guó)mb支原體qpcr檢測(cè)試劑盒，通過(guò)歐洲藥典和日本藥典的方法學(xué)驗(yàn)證。
表達(dá)轉(zhuǎn)基因t細(xì)胞受體(tcr)或嵌合抗原受體(cars)的t細(xì)胞，已成為一些惡性腫瘤的有效治療選擇。然而，t細(xì)胞功能可因慢性刺激而失效。慢性刺激的t細(xì)胞可以分化為功能失調(diào)狀態(tài)，其特征是抑制受體(如pd-1, lag-3和tim-3)的表達(dá)，增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少，轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)景觀改變。以衰竭為特征的t細(xì)胞功能障礙已被確定為治療反應(yīng)不良的主要原因因此，在包括慢性刺激和強(qiáng)直信號(hào)在內(nèi)的環(huán)境中，改善治療性t細(xì)胞的適應(yīng)性是改善臨床反應(yīng)的一個(gè)有希望的策略。
基因組工程的進(jìn)步提供了許多增加t細(xì)胞適應(yīng)性的方法。
一種方法是在內(nèi)源性tcr α常數(shù)(trac)鏈13的啟動(dòng)子調(diào)控下，通過(guò)靶向car整合或篩選共刺激結(jié)構(gòu)域來(lái)確定有利的car設(shè)計(jì)來(lái)調(diào)節(jié)car調(diào)節(jié)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
第二種方法使用crispr-cas9去除限制持久t細(xì)胞功能的基因。從pd -1開(kāi)始，crispr - cas9介導(dǎo)的抑制受體敲除(ko)已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了嘗試功能喪失篩選繼續(xù)指出了增加t細(xì)胞適應(yīng)性的擾動(dòng)，如regnase-1和/或roquin，ptpn2，socs1，或rasa2。
作為第三種方法，使用crispr激活(crispra)25或開(kāi)放閱讀框(orf)的慢病毒文庫(kù)進(jìn)行的功能獲得篩選，已經(jīng)揭示了其可能性，如淋巴蛋白β受體(ltbr)的過(guò)表達(dá)。然而，這些功能獲得篩選方法并沒(méi)有在原代人t細(xì)胞中大規(guī)模地與抗原特異性tcr或car結(jié)合，而且crispra篩選不能測(cè)試合成的基因產(chǎn)物。
一種很有前景的方法是通過(guò)直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子或通過(guò)合成表面受體(srs)改變細(xì)胞對(duì)外部信號(hào)的反應(yīng)來(lái)設(shè)計(jì)tcr-/car-t細(xì)胞的狀態(tài)。例如，過(guò)表達(dá)ap-1/atf轉(zhuǎn)錄因子(tf) c-jun或batf可以改善car-t細(xì)胞功能。許多研究小組設(shè)計(jì)了編碼“開(kāi)關(guān)”受體的合成基因，通過(guò)將抑制受體的結(jié)構(gòu)域(如pd-1)融合到激活結(jié)構(gòu)域(如cd28)，將抑制信號(hào)轉(zhuǎn)化為激活信號(hào)。包括cd200r/cd28和tim-3/cd28在內(nèi)的一系列合成受體已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，但需要系統(tǒng)的分析來(lái)了解控制哪些結(jié)構(gòu)域配對(duì)有效的規(guī)則。更廣泛地說(shuō)，需要一種模塊化篩選方法來(lái)發(fā)現(xiàn)可以與特定tcr /cars結(jié)合的tf或sr的組合，以提高功能性能。
靶向crispr介導(dǎo)的敲入蛋白(ki)篩選不僅允許在特定位點(diǎn)上測(cè)試構(gòu)建體，而且還克服了匯集的lenti /逆轉(zhuǎn)錄病毒篩選方法的幾個(gè)局限性:病毒重組、半隨機(jī)整合和可變整合數(shù)。研究人員之前開(kāi)發(fā)了一個(gè)非病毒池ki (poki)平臺(tái)，并篩選了一個(gè)包含36個(gè)成員的庫(kù)，結(jié)合ny - eso -1特異性tcr。然而，由于模板切換導(dǎo)致的大量條形碼/構(gòu)建錯(cuò)配阻礙了該方法的擴(kuò)展，這限制了庫(kù)的大小和適應(yīng)性。
近日，科研人員開(kāi)發(fā)了模塊化池ki篩選(modpoki)，這是一個(gè)使用條形碼多順子適配器模塊化構(gòu)建dna ki庫(kù)的適應(yīng)性平臺(tái)。相關(guān)研究發(fā)表在《cell》上，文章標(biāo)題為：“modular pooled discovery of synthetic knockin sequences to program durable cell therapies”。
研究人員構(gòu)建了兩個(gè)modpoki文庫(kù)，包含100個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(tf)和129個(gè)天然和合成表面受體(srs)。在不同條件下對(duì)人類tcr-和car-t細(xì)胞進(jìn)行了30多次modpoki篩選，發(fā)現(xiàn)了一種轉(zhuǎn)錄因子ap4 (tfap4)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在體外和體內(nèi)增強(qiáng)了慢性刺激car-t細(xì)胞的適應(yīng)性和抗癌功能。modpoki的模塊化使我們能夠生成一個(gè)約10,000個(gè)成員的tf組合庫(kù)。batf-tfap4多順?lè)措娮咏Y(jié)構(gòu)的非病毒ki增強(qiáng)了適應(yīng)度。過(guò)表達(dá)的batf和tfap4共同占據(jù)并調(diào)控關(guān)鍵基因靶點(diǎn)，重編程t細(xì)胞功能。modpoki有助于發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)來(lái)編程細(xì)胞功能?？偟膩?lái)說(shuō)，這些研究強(qiáng)調(diào)了大規(guī)模modpoki篩選是一種強(qiáng)大的方法，可以加速細(xì)胞狀態(tài)的編程，增強(qiáng)持久性和治療功能。