pcr 技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，pcr)是由美國 pe cetus 公司的 kary mullis 在 1983 年(1993 年獲諾貝爾化學(xué)獎)建立的。其原理類似于dna的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。即通過模擬體內(nèi)dna復(fù)制條件，在體外特異性擴(kuò)增dna片段的一種技術(shù)。
熒光定量pcr(qpcr)是pcr較為傳統(tǒng)的pcr技術(shù)，經(jīng)過多年的發(fā)展，已是很成熟的實驗方案了。其中，常用的是taqman法和sybr green法。而在這二種方法當(dāng)中，taqman法又以其特異性高、定量，得到廣大用戶的認(rèn)可。
但事實上taqman法熒光pcr還是一個相對定量的辦法。它測的是一個ct值，也就是pcr到第幾個循環(huán)，熒光強(qiáng)度達(dá)到了一個設(shè)定值。要想用taqman方法得到：樣本中到底有幾個目標(biāo)基因的拷貝，那么還是要再做一個標(biāo)準(zhǔn)品的(qpcr)曲線。才能知道樣本的ct值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的哪個位置上。再進(jìn)一步推算出樣本中的拷貝數(shù)量。
這樣做，它首先要做一個標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣的話，一來增加了工作量，另一方面，因為引入了標(biāo)準(zhǔn)品，也會產(chǎn)生相應(yīng)的誤差，導(dǎo)致實驗中又多引入了一個實驗的誤差變量。
科學(xué)家為了克服傳統(tǒng)定量pcr的上述兩個弱點，那么又新發(fā)明了微滴數(shù)字pcr。 數(shù)字pcr(digital pcr-dpcr)技術(shù)是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統(tǒng)定量pcr(qpcr)技術(shù)不同，數(shù)字pcr采用定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。 由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)qpcr更加出色的靈敏度和特異性、性，dpcr迅速得到廣泛的應(yīng)用，這項技術(shù)在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達(dá)量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認(rèn)可，而其在基因表達(dá)研究、microrna研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、ngs測序文庫定量和結(jié)果驗證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景，已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。 數(shù)字pcr在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域哪些研究方向發(fā)揮重要作用呢？小編盤點了以下11個研究方向。
1. 基因表達(dá)差異研究
檢測時*不依賴傳統(tǒng)的ct值即可實現(xiàn)真正意義上的定量，從而提供了比實時熒光定量pcr更的基因差異表達(dá)研究，尤其對于那些靶基因表達(dá)差異微小的情況：microrna、lncrnas等的表達(dá)分析、等位基因的不平衡表達(dá)、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、exosome內(nèi)核酸分子定量分析等。
2. 拷貝數(shù)變異(cnv)研究
微滴化的樣品處理及檢測，這種擺脫ct值的計算方法而直接獲取目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，為拷貝數(shù)變異的研究提供了的檢測精度。是其他諸如二代測序、芯片雜交等平臺無法達(dá)到的，因此采用數(shù)字pcr能夠有效對ngs、acgh的實驗結(jié)果進(jìn)行驗證，并具有成本低、通量高的特點。
3. 低豐度及稀有序列的定量
目前對于低豐度目標(biāo)序列的檢測，定量pcr、雜交、毛細(xì)管測序及ngs等方法都因受到背景dna的干擾，使得檢測靈敏度及性都達(dá)不到精細(xì)定量的要求(如定量pcr檢測中ct值大于33的情況下，其重復(fù)性就不是很高)， 而微滴式數(shù)字pcr系統(tǒng)通過核心的微滴化處理，使得稀有的核酸序列從大量的背景dna中分離出來，從而提高了檢測的靈敏度及重復(fù)性。
此外，由于樣品微滴化處理的同時，也將樣品中可能存在的抑制劑進(jìn)行了分裝，提高了數(shù)字pcr擴(kuò)增對于抑制劑的耐受程度，因此可具體應(yīng)用于很多臨床樣品(血液、尿液、糞便、痰液、腦脊液等)中對腫瘤核酸標(biāo)記物的檢測。一般而言，毛細(xì)管電泳和定量pcr的檢測靈敏度約在10%;ngs的靈敏度可達(dá)到1%;而ddpcr的檢測下限為0.001%。
4. 甲基化含量鑒定
作為表觀遺傳學(xué)研究中重要的一個研究方向——甲基化程度分析，現(xiàn)階段有不同的方法或技術(shù)來進(jìn)行研究：如傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測序統(tǒng)計法、抗體檢測法、定量pcr檢測法等。這些方法皆因方法學(xué)的問題而不能獲得的定量，而微滴式數(shù)字pcr系統(tǒng)通過對樣品的微滴化處理及目標(biāo)因子的拷貝數(shù)定量，為甲基化程度的定量檢測提供了一種全新的技術(shù)。
5. *的伴隨診斷
常用體液來源(如血液，胸腹水，唾液及尿液等)的待檢標(biāo)本中的dna，有正常脫落體細(xì)胞和病變脫落細(xì)胞兩種來源，前者的量遠(yuǎn)大于后者。通過微液滴處理能在每個微液滴中有效減少正常體細(xì)胞dna的干擾，實現(xiàn)腫瘤標(biāo)記物的有效檢測，如egfr，alk，ros1，kras、braf等基因的突變檢測、乳腺癌/胃癌的her2基因擴(kuò)增檢測等，應(yīng)用于腫瘤醫(yī)學(xué)的伴隨診斷。
6. 無創(chuàng)*
無創(chuàng)傷的產(chǎn)前診斷, 如21號染色體為3倍體的唐氏綜合征、已知父母基因型的胎兒地貧檢測或已知父母基因型的其它核酸病檢測(孟德爾相關(guān)遺傳疾病)。目前標(biāo)本來源主要為血液，而待檢測的胎兒dna受到母體dna的干擾，影響了檢測的準(zhǔn)確性。而qx200檢測系統(tǒng)*的微滴化技術(shù)*可以作為二代測序法的補(bǔ)充來進(jìn)行的無創(chuàng)傷產(chǎn)前診斷，從而提高工作效率及節(jié)約成本。
7. 病原微生物的檢測(病毒、細(xì)菌等)
疾病預(yù)防控制中心、出入境檢驗檢疫局系統(tǒng)的實驗室目前主要采用基于taqman探針法的定量pcr體系對病原微生物進(jìn)行核酸水平的檢測，而這些目前正在使用著的檢測體系可以無縫地轉(zhuǎn)移到qx200上，從而滿足該類實驗室對于檢測結(jié)果的要求：靈敏度更高、重復(fù)性更好、無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量結(jié)果，同時操作簡便。
對于其他類型的研究實驗室，也可以利用ddpcr靈敏度高的特點，對各種樣品中的病原微生物展開廣泛的研究。如hiv抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療過程中病毒殘留量的監(jiān)控;hbv耐藥突變的檢測;hcv的分子分型;抗**的院內(nèi)感染監(jiān)控;環(huán)境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等等。
8. 轉(zhuǎn)基因食品或成分的檢測
目前在確定轉(zhuǎn)基因作物或成分的含量時采取定量pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線法，這種方法需要依賴于已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(certified reference materials calibrants, crmcs)。ddpcr定量的方式可以*解決這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定標(biāo)工作。
9. 二代測序輔助建庫
目前靶向測序建庫方法包括擴(kuò)增子方法，在均相溶液中，當(dāng)擴(kuò)增引物增加時，由于擴(kuò)增引物之間的相互作用，從而影響擴(kuò)增的效率;如果將其分散到大量微液滴中擴(kuò)增，將可大大降低引物間相互作用，提高擴(kuò)增效率。同時還可以實現(xiàn)對于少量模板的有效擴(kuò)增，得到更多的有效測序數(shù)據(jù)。
10. crispr-cas9基因編輯結(jié)果驗證
crispr-cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗證實驗是否成功，仍需要高靈敏度的檢測方法，數(shù)字pcr技術(shù)可以滿足這一需求。broad研究所張鋒團(tuán)隊發(fā)明了以crispr為基礎(chǔ)的sherlock技術(shù)可以對核酸進(jìn)行高靈敏度的定性檢測，但定量評估時仍采取了數(shù)字pcr進(jìn)行確認(rèn)。
11. *的實時監(jiān)控
已有數(shù)篇文章報道了使用數(shù)字pcr技術(shù)對患者治療過程中的循環(huán)腫瘤dna(ctdna)進(jìn)行檢測，實時監(jiān)控疾病進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和腸癌等多種腫瘤患者中都取得了令人鼓舞的結(jié)果。與影像學(xué)及其他常規(guī)指標(biāo)相比，ctdna突變及豐度改變通常會提前數(shù)月出現(xiàn)，這樣就可以提醒醫(yī)生及時調(diào)整治療方案，使患者得到更有效的治療。
隨著數(shù)字pcr熒光通道的增加和多指標(biāo)檢測的成熟，數(shù)字pcr將會進(jìn)入更多應(yīng)用領(lǐng)域，有力推動生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的快速發(fā)展。