摘要：本文介紹了采用 agilent ultivo 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)*中的亞硝胺類雜質(zhì) n-亞硝基-n-甲基-4-氨基丁酸 (nmba) 的方法。該方法采用常規(guī) esi 源，即可獲得滿足檢測(cè) 要求的分析結(jié)果，且方法簡(jiǎn)單、特異性高、靈敏度可達(dá) 0.005 ppm，大大優(yōu)于 fda公 布的*，非常適用于對(duì)*類產(chǎn)品中的 nmba 進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的定量分析。
前言：2019 年 3 月 1 日，美國(guó)食品* (fda) 在[1] 發(fā)布公告，對(duì)用于治療高血壓 和心力衰竭的多種通用血管緊張素 ii 受體阻滯劑 (arb) 藥品自愿召回。導(dǎo)致此次召回的主 要原因是發(fā)現(xiàn)其中含有 nmba 雜質(zhì)，這是在 arb 藥物中檢測(cè)到的第三種亞硝胺類遺傳毒 性雜質(zhì)。 nmba 全稱 n-亞硝基-n-甲基-4-氨基丁酸 (n-nitroso-n-methyl-4-aminobutyricacid，cas 號(hào) 61445-55-4），結(jié)構(gòu)如圖 1 所示，屬于亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)。根據(jù) fda 初步評(píng)估， nmba 暴露患者的癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加似乎與 n-亞硝基二jia胺 (ndma) 暴露相同，但低于 n-亞硝 基二乙胺 (ndea) 暴露的風(fēng)險(xiǎn)。fda 目前給出的 nmba 可接受*是 96 ng/天，在 arb 藥物中臨時(shí)限度為 0.96 ppm[1]。
關(guān)于*中 nmba 的檢測(cè)，歐洲 omcl 實(shí)驗(yàn)室 2019 年 4 月 公布了 lc-ms/ms（apci 源）方法[2]，fda 于同年六月份公布了 lc-hrms 方法和 rapidfire-ms/ms 方法[3,4]，而 fda 這兩種方法 都不是實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的定量分析平臺(tái)。 本文采用配置了 esi 源的 agilent ultivo 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) 進(jìn)行 nmba 檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性高且重現(xiàn) 性好，可有效地應(yīng)用于*中 nmba 的定量分析。
實(shí)驗(yàn)部分：試劑和樣品 甲醇為質(zhì)譜級(jí)，甲酸為色譜級(jí)，購(gòu)于 merck；所用實(shí)驗(yàn)用水為 millipore milli-q 超純水系統(tǒng)現(xiàn)制備的高純?nèi)ルx子水；nmba 標(biāo)準(zhǔn) 品和樣品由合作用戶提供。 儀器和設(shè)備 采用 agilent 1290 infinity ii 超高效液相色譜系統(tǒng)與 ultivo 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)配備如下：二元泵（部件 號(hào) g7120a）、自動(dòng)進(jìn)樣器（部件號(hào) g7167b）、柱溫箱（部件號(hào) g7116b）。 色譜柱選用 agilent infinitylab poroshell 120 ec-c18（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件號(hào) 695775-902）。另?yè)?jù)用戶驗(yàn)證，agilent infinitylab poroshell 120 ec-c8（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件號(hào) 695775-906）也可以達(dá)到相似的效果。 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精確稱取 nmba 標(biāo)準(zhǔn)品，加水超聲溶解，并定量稀釋制成每 1 ml 中含 1 mg 目標(biāo)化合物的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用水逐級(jí)稀釋 成每 1 ml 中分別包含 0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100 ng 目標(biāo)化合物的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品線性系列溶液。線性范圍和相關(guān) 濃度點(diǎn)可根據(jù)檢測(cè)需要自行調(diào)整樣品前處理 取*樣品約 10 mg，加 1 ml 水，搖勻，超聲溶解。
液相色譜條件： 色譜柱： poroshell 120 ec-c18, 2.1 × 100 mm, 2.7 μm 流速： 0.4 ml/min 柱溫： 35 °c 流動(dòng)相： a) 含 0.1% 甲酸的水溶液 b) 甲醇 梯度程序： 時(shí)間 (min) b (%) 0.00 5.00 0.50 5.00 2.50 20.00 3.00 98.00 6.00 98.00 6.10 5.00 7.00 5.00 后運(yùn)行時(shí)間： 1 min
結(jié)果與討論：色譜分離結(jié)果 *原料藥體系相對(duì)簡(jiǎn)單，可采用常規(guī)反相色譜體系（c18 或 c8 柱）進(jìn)行分離。初始高比例水相主要用于洗脫鉀鹽，避免 高濃度鹽的離子抑制效應(yīng)影響回收率。在本研究中所用的色譜條 件下，nmba 的保留時(shí)間約為 2.3 分鐘。隨后的高比例有機(jī)相用 于洗脫氯沙坦。由于氯沙坦?jié)舛群芨?，為避免污染質(zhì)譜系統(tǒng)，建 議將流路設(shè)置為“引入廢液”。 因?yàn)槭芟拗频?n-n 鍵存在順?lè)唇Y(jié)構(gòu) (syn and anti conformers)[5]， nmba 在色譜體系中表現(xiàn)為雙峰，本研究中所用的色譜條件可以 實(shí)現(xiàn)兩種異構(gòu)體的基線分離（圖 2）。不過(guò)，在 nmba 定量分析 中，需要對(duì)兩個(gè)峰積分并合并峰面積[3]。