反相色譜柱是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。與hic一樣，rpc中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，rpc固定相表面*被非極性基團(tuán)所覆蓋，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疏水性。因此，必須用極性有機(jī)溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。能影響反相色譜柱因素有哪些：
(1)柱長
有機(jī)小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加．但是柱長增加并不能使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加．它們?cè)谳^短的柱子上往往也有很好的分離效果。
(2)流動(dòng)相的流速。
有機(jī)小分子和肽類的分辨率對(duì)流動(dòng)相流速非常敏感。而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小，柱子越長，色譜峰的寬度就越大，分辨率就越小。制備色譜上樣過程中的流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附容量影響很大。
(3)溫度。
溫度上升，流動(dòng)相黏度下降，流動(dòng)速度加快，且流動(dòng)相與固定相之間的傳質(zhì)速度加快，使分辨率增加。同時(shí)，溫度上升，分子熱運(yùn)動(dòng)增加，疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標(biāo)物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。
(4)流動(dòng)相組成。
流動(dòng)相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大，洗脫時(shí)間越長。rpc多采用降低流動(dòng)相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性醉強(qiáng)的溶劑，在反相色譜中常常和基礎(chǔ)溶劑配合使用，向流動(dòng)相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑，以得到不同強(qiáng)度的流動(dòng)相，這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈。此外，乙醇、四氫呋南、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。有機(jī)溶劑梯度的大小也會(huì)影響分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。