苑玲玲
苑玲玲，博士，2014年畢業(yè)于university of nebraska-lincoln，專業(yè)為plant breeding and genetics。同年，加入li-cor公司環(huán)境部，現(xiàn)為應(yīng)用科學(xué)家。
你用400 ppm min-1來ramp，就意味著做整條a-ci曲線（例如從10ppm-1600ppm），只需要4min，這就大大縮短了測量時間【考慮到種內(nèi)和種間差異，具體ramp參數(shù)設(shè)置，請通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定】。新技術(shù)顯著縮短了測量耗時，大大提升了測量效率。
新技術(shù)和傳統(tǒng)方法得到的vcmax、jmax和二氧化碳補(bǔ)償點(diǎn)吻合度高。但是，傳統(tǒng)方法測量得到的原始數(shù)據(jù)點(diǎn)少，曲線擬合出來的參數(shù)具有更大的不確定性。除了a-ci曲線，這項(xiàng)新技術(shù)也在調(diào)查類測量（survey measurement）和光響應(yīng)曲線測量（a-q curve）方面做了驗(yàn)證。
li-cor 苑玲玲：li-6800測量新技術(shù)dat.mp3
a new technique for gas exchange measurements: dynamic assimilationtm
2021.10.16 武漢
各位老師同學(xué)，大家好！今天給大家介紹一項(xiàng)用于葉片氣體交換測量的新技術(shù)。
叫做dynamic assimilationtm，或者是叫dynamic assimilationtmtechnique。首字母的縮寫就是dat（動態(tài)吸收測量技術(shù)）。
首先我們簡要回顧一下氣體交換測量的歷史，之后我會給大家介紹目前所使用的測量技術(shù)，然后我會重點(diǎn)談一下dat。
世界人口的急劇增長使得人們對于糧食和能源的要求不斷增大，這就刺激了光合作用的研究。而對于光合作用研究的需求，又推動了相關(guān)儀器和測量技術(shù)的發(fā)展。
回顧歷史，100年前，大約是在1920年左右的時候，研究人員通過化學(xué)試劑滴定的方法來測量葉片對于co2的吸收，作為評估葉片光合能力的指標(biāo)。核心原理就是利用co2與氫氧化鋇產(chǎn)生碳酸鋇沉淀，然后用酸來滴定中和，通過對比空白組所需酸的量的差別來計(jì)算葉片對于co2的吸收。
人工搭建的這個設(shè)備，大家可以看到這張圖，操作起來費(fèi)時費(fèi)力，這張圖顯示了當(dāng)時所用的設(shè)備。圖片出自下面這篇paper，引用過來的。這張圖顯示的就是通過這種滴定方法測得的一天中甘蔗葉片對于co2吸收的日變化。
到了上個世紀(jì)四五十年代，紅外線氣體分析儀逐漸發(fā)展了起來，人們便開始把這個紅外線氣體分析儀用在光合測量設(shè)備里面。
當(dāng)時很多設(shè)備因?yàn)轶w積龐大、操作繁瑣，基本只能在室內(nèi)使用。但是因?yàn)榇蠹覍敉鉁y量是很有需求的，所以一些可移動的設(shè)備也被研發(fā)出來，如像這個slide右手邊這種。
到了上個世紀(jì)八十年代、九十年代的時候，li-cor公司研發(fā)的li-6200、li-6400相繼問世，可以說是拎起來就走，之后更*的li-6800問世，那就更方便了，操作直觀，自動化控制。
回顧歷史，我們可以看到，人們對于光合測量設(shè)備的不斷追求，為光合研究提供了新工具。
現(xiàn)在市面上的氣體交換測量系統(tǒng)，一般都是采用開路式的方法、開放式氣路（進(jìn)行測量）。
所謂開放式氣路，顧名思義是指非封閉。氣流持續(xù)的有進(jìn)有出。對li-6800來說，外界的空氣進(jìn)入主機(jī)，水汽、co2濃度被調(diào)適以后，出來，進(jìn)入分析器。分流，一路不接觸葉片直接被測量，叫做reference，作為對照。另外一路經(jīng)過葉片，然后被測量，叫做sample，最后氣流排到外界。anyway，就是說氣流有進(jìn)有出，這是一個開放式氣路。那么在葉片所在的這個位置，就是葉室這個地方，具體發(fā)生了什么呢？
這個長方形代表整個葉室部分，氣流流經(jīng)葉室，進(jìn)氣流速為u1，進(jìn)氣流中co2濃度為c1,水汽濃度為w1，出葉室的co2濃度c2，水汽濃度w2，這些指標(biāo)都會被儀器直接測量記錄。由于葉片的光合作用吸收co2，蒸騰作用釋放水汽，這就是所謂的氣體交換，使得c1和c2之間，w1和w2之間存在差值，這個差值用于計(jì)算co2同化速率和蒸騰速率。
在這個公式里，a代表co2同化速率，e代表蒸騰速率，s代表葉面積?；趯@個氣流水汽和co2濃度的測量，蒸騰速率和co2同化速率就用這兩個公式計(jì)算出來。這里需要注意的一點(diǎn)是，這兩個公式是基于“steady state，或者說是穩(wěn)定狀態(tài)。長久以來，開路式氣體交換測量，都是依賴于“steady state。
那你可能要問了，什么叫“steady state呢？它是指葉室情況穩(wěn)定，達(dá)到一個穩(wěn)定狀態(tài)，就是說co2，c1和c2達(dá)到一個恒定值，水汽w1和w2達(dá)到一個恒定值，氣流u1和u2也要達(dá)到一個恒定狀態(tài)。
一旦不穩(wěn)定，用這個公式計(jì)算出來的co2同化速率就是不對的了。比如說，當(dāng)葉室是空的、關(guān)閉的，沒有葉片的時候，測得的co2的同化速率應(yīng)該是零，對吧。因?yàn)闆]有葉片，不管你的co2濃度控制是多少，或者怎樣變化，光合值應(yīng)該都為零，但是市面上光合儀的表現(xiàn)，卻不是這樣。
大家會經(jīng)常注意到，如果你改變co2濃度，比如像左邊這張圖，co2控制從400ppm到600ppm，您能看到光合值突然有很大的波動，然后再逐漸的回歸到零。
這就意味著，在記錄數(shù)據(jù)的時候，你需要等待，需要等待葉室又重新達(dá)到一個新的steady state后，才能記錄數(shù)據(jù)。大家能看到，這兩張圖中，前30秒的階段是一個steady state，大概70s以后，也是一個steady state，從30s到70s之間，是一個non-steady state，就是一個非穩(wěn)定狀態(tài)。
如果您在non-steady state階段記錄數(shù)據(jù)，那您的數(shù)據(jù)就是不對的。
那有沒有一個方法可以實(shí)現(xiàn)更快的氣體交換測量呢？
幾年前，li-cor聯(lián)合the university of new mexico的研究人員，推出了一項(xiàng)新技術(shù)叫做racirtm，racirtm用于co2響應(yīng)曲線的測量。它是通過ramp co2濃度（連續(xù)降低或升高co2的濃度），像左邊這張圖，之后通過空葉室校正來得到最終的數(shù)據(jù)。racirtm讓使用者可以更快的測量a-ci曲線，進(jìn)而得到vcmax等參數(shù)，這讓快速篩選成為可能。
另外由于co2是連續(xù)變化的，儀器在連續(xù)的快速記錄數(shù)據(jù)，因此能獲得大量的數(shù)據(jù)點(diǎn)。大量的數(shù)據(jù)點(diǎn)，對于a-ci曲線的擬合是大有幫助的。但racirtm是有局限性的，只能用于a-ci曲線的測量，不能用于其他類型的測量，如調(diào)查式測量（survey measurement）或光響應(yīng)曲線的測量（a-q curve）。
另外racirtm所用的這個co2ramp rate，不能太快，局限于100ppm/min。另外racirtm需要空葉室校正過程。測量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，依賴于空葉室校正的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。
那有沒有一項(xiàng)技術(shù)，可以突破racirtm的這種局限呢？比如說co2ramp rate能不能更快一些? 除了a-ci曲線的測量，可不可以應(yīng)用到其他類型的測量上呢？
下面我就用一些slides，來講一講由li-cor研發(fā)并成功應(yīng)用到li-6800的這項(xiàng)新技術(shù)。
其實(shí)對于開放式測量系統(tǒng)，它的fundamental質(zhì)量平衡公式是這個，相比之前的slide，這個公式里多了一項(xiàng)，就是這個dc/dt。這個公式很好理解，這個u1c1，代表了有多少co2進(jìn)入了葉室，u2c2是多少co2離開了葉室，sa這一項(xiàng)是多少co2被吸收，這個dc/dt就是葉室內(nèi)的co2濃度隨時間的變化。
在steady state的情況下，dc/dt為零。就是說葉室內(nèi)的co2濃度隨時間是不變的。當(dāng)dc/dt=0時，通過推導(dǎo)，你能看到這個a值，就是在steady state下使用的公式。
所以，steady state下使用的公式是fundamental質(zhì)量平衡方程的一種特殊狀態(tài)，即dc/dt=0。
那么不在steady state的情況下，或者說dc/dt不等于0的情況下，這個等式就是一個dynamic質(zhì)量平衡方程。在這種情況下，你把a(bǔ)值推導(dǎo)出來，就是右邊這個公式。這個公式可以說是dynamic assimilationtmtechnique（動態(tài)吸收測量技術(shù)）的核心公式。
因?yàn)閘i-6800的性，比如說，快速精準(zhǔn)連續(xù)的環(huán)境條件控制、葉室緊靠分析儀，以及range match功能，使得dynamic assimilationtmtechnique（動態(tài)吸收測量技術(shù)）這項(xiàng)新技術(shù)可以整合進(jìn)li-6800系統(tǒng)。
經(jīng)驗(yàn)證，這項(xiàng)新技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的steady state的測量方法以及racirtm。
我們做空葉室實(shí)驗(yàn)，就是用關(guān)閉的空葉室，co2的同化速率a應(yīng)該為零。當(dāng)co2濃度改變后，比如co2濃度從400ppm提升到600ppm，基于steady state的技術(shù)測量的數(shù)據(jù)點(diǎn)是右圖中紅色的curve，能看到，co2同化速率a會有一個大的波動，等待一段時間（約40s）后，才會重新回到零。
基于這項(xiàng)新技術(shù)，co2同化速率a，也就是這個藍(lán)色的curve，只有一個小小的波動，并且很快（約5s）就回到了零。這意味著，在測量葉片的時候，等待的時間會大幅減少。
這張slide，同樣是空葉室實(shí)驗(yàn)，沒有葉片，co2濃度從0ppm改變到1600ppm，連續(xù)變化的整個過程中，大家看到，這個藍(lán)色的curve，是使用新技術(shù)dynamic assimilationtmtechnique（動態(tài)吸收測量技術(shù)）測量得到的凈光合速率a，整個過程一直保持在0附近。但是傳統(tǒng)的測量方法，a值會有很長一段時間（約500s）的升高，當(dāng)co2穩(wěn)定以后，傳統(tǒng)測量方法得到的a值才會重新回到0。
除了在空葉室的驗(yàn)證，以下這些slides通過真實(shí)的測量葉片來驗(yàn)證這項(xiàng)新技術(shù)的優(yōu)勢。
下面左邊這張圖比對了三種不同的方法，做的a-ci響應(yīng)曲線，其中，藍(lán)色、紅色代表是dynamic assimilationtmtechnique（動態(tài)吸收測量技術(shù)），黃色代表的是racirtm，紫色的方塊和紅色的×是傳統(tǒng)方法所測量的a-ci響應(yīng)曲線。大家能看到這些結(jié)果是基本吻合的，dat #1和#2有什么區(qū)別呢？co2ramp速率是不一樣的，#1是200ppm/min, #2是400ppm/min。實(shí)驗(yàn)樣品是向日葵葉片。大家可以看到，對于向日葵葉片來說，兩個ramp速率，結(jié)果差別很小。
你用400ppm/min來ramp，就意味著做整條a-ci曲線（10ppm-1600ppm），只需要4min，這就大大縮短了測量時間。傳統(tǒng)測量方法，一條a-ci響應(yīng)曲線需要~30min。右邊這張圖就是curve起始階段放大后的圖，大家可以看到，新技術(shù)和傳統(tǒng)方法得到vcmax、jmax和二氧化碳補(bǔ)償點(diǎn)是基本吻合的。但是，傳統(tǒng)方法測量得到的數(shù)據(jù)點(diǎn)少，曲線出來的參數(shù)具有更高的不確定性。那除了a-ci曲線，這項(xiàng)新技術(shù)也在調(diào)查類測量方面做了驗(yàn)證，并且有明顯的優(yōu)勢。
下面這個實(shí)驗(yàn)是調(diào)查式測量，一開始這個葉室為關(guān)閉狀態(tài)，空葉室co2r和co2s都是穩(wěn)定的，起始階段co2同化速率a也是穩(wěn)定的。然后在這個時間點(diǎn)，葉室被打開，打開以后夾上葉片，關(guān)閉葉室，葉片之前做過光適應(yīng)，藍(lán)線是用新技術(shù)測量得到的co2同化速率，紅色是傳統(tǒng)方法測量得到的co2同化速率，可以明顯的看到，這個新技術(shù)回到穩(wěn)定狀態(tài)更快。最右邊這張圖就是畫圈部分的放大圖，傳統(tǒng)方法滯后約20-30s。
另外，這項(xiàng)新技術(shù)也能用于光響應(yīng)曲線（a-q curve）的測量。由于植物響應(yīng)光強(qiáng)變化要慢于co2的變化，使用這項(xiàng)新技術(shù)做光響應(yīng)曲線測量時，光強(qiáng)的ramp rate不能太快，因此完成光響應(yīng)曲線所需要的時間與傳統(tǒng)的常規(guī)方法是接近的。新技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是數(shù)據(jù)點(diǎn)多，有助于更準(zhǔn)確的曲線擬合。
總結(jié)一下，dynamic assimilationtm（動態(tài)吸收測量技術(shù)）在三種重要的測量類型中，都可以應(yīng)用，尤其是在a-ci曲線測量和調(diào)查類測量中，新技術(shù)顯著提高了測量速度，密集的數(shù)據(jù)點(diǎn)有助于曲線擬合；在光響應(yīng)曲線（a-q curve）的測量中，優(yōu)勢體現(xiàn)在密集的數(shù)據(jù)采樣上。
這項(xiàng)新技術(shù)是由li-cor的兩位科學(xué)家aaron j saathoff和jon welles共同開發(fā)，并成功整合應(yīng)用到了li-6800里面。關(guān)于這項(xiàng)新技術(shù)的文章，兩個月前發(fā)表在plant cell& environment雜志上，題目是gas exchange measurements in the unsteady state（doi.org/10.1111/pce.14178）。這篇文章是open access的，大家感興趣的可以找來讀一下。好，今天我的報(bào)告就到這里，謝謝大家。
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