在過去的幾十年中，人脂肪源性間充質(zhì)干細胞（ascs）的多向分化能力因其在基于干細胞的治療策略中的潛在應(yīng)用而得到了廣泛的研究。目前正在探索基于干細胞的療法來治療眼部疾病，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變（dr），其中血管并發(fā)癥導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障（brb）破壞。
微循環(huán)損傷主要歸因于周細胞的不可逆丟失，這是dr的早期標(biāo)志，因為在成人視網(wǎng)膜中，周細胞無法復(fù)制。高血糖引起的活性氧（ros）的過量產(chǎn)生刺激炎癥過程，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管損傷。在dr患者中發(fā)現(xiàn)不同炎性細胞因子（如il-1β）和腫瘤壞死因子-α（tnf-α）水平升高?；罨男∧z質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和大膠質(zhì)細胞參與這些細胞因子的分泌，其積累有助于神經(jīng)元死亡。此外，血管內(nèi)皮生長因子（vegf）和血管生成素-2等促血管生成因子已被證明可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖，最終導(dǎo)致血管通透性增加和破裂。
基于干細胞的療法可能是抵消周細胞丟失和減緩疾病進展的寶貴工具。體外實驗和dr小鼠模型曾報道了令人鼓舞的結(jié)果。在意大利卡塔尼亞大學(xué)生物醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)科學(xué)系團隊之前的體外研究中，通過在專為周細胞（pm）設(shè)計的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ascs，實現(xiàn)了ascs的周細胞樣分化。結(jié)果，獲得了平滑肌肌動蛋白α（α-sma）和神經(jīng)膠質(zhì)抗原2（ng2）的過表達，以及它們典型的腎小管周圍定位。此外，周細胞樣分化ascs和人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞（hrecs）的共培養(yǎng)誘導(dǎo)了連接蛋白的表達增加。它們也將被稱為pmascs，因為它們的分化過程也是通過使用pm實現(xiàn)的。
該團隊下一項研究的目的是進一步探索通過相同分化方案獲得的這些pmascs的行為，特別是，為了模擬糖尿病患者發(fā)生的狀況，在向培養(yǎng)基中加入葡萄糖后測量和比較各種參數(shù)。實驗評估了細胞增殖、細胞活力及其遷移能力；還測量了ros的產(chǎn)生以及促炎（tnf-α和il-1β）和抗炎（tgf-β1和il-10）細胞因子、促血管生成因子（vegf，血管生成素-2和mmp-9）的mrna表達；最后通過3d共培養(yǎng)評估了pmasc對hrec組織管狀形成能力的影響。在這些結(jié)果中獲得的周細胞樣ascs代表了治療糖尿病患者視網(wǎng)膜損傷的寶貴數(shù)據(jù)。
首先，進行細胞增殖和活性檢測。盡管存在顯著差異，但在所有測試的asc群體中均觀察到高增殖率。圖1顯示了所研究的所有四個亞組中典型的成纖維細胞樣形態(tài)。可以觀察到，無論葡萄糖濃度如何，pmasc培養(yǎng)物中存在更密集的細胞群（圖1 b、d），在較長時間內(nèi)可能會注意到輕微下降。添加葡萄糖對這些細胞種群的影響不顯著。相反，高葡萄糖濃度對人視網(wǎng)膜周細胞（hrpcs）的增殖率產(chǎn)生負面影響，其增殖率逐漸降低，特別是在葡萄糖添加72小時。通過mtt測定細胞活力，pmascs與ascs在每個時間點的任何葡萄糖濃度下都顯示出相似的高值，相反，在hrpc種群中測量到較低值，添加葡萄糖48小時和72小時后逐漸觀察到顯著下降。
圖1 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（asc）或周細胞培養(yǎng)基（pmasc）中培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細胞的代表性顯微照片，在細胞增殖測定期間用結(jié)晶紫染色。在各自的培養(yǎng)基中生長三天后，在一些樣本（高葡萄糖，25 mm）中添加葡萄糖，而其他樣本則保持在正常葡萄糖（ng）狀態(tài)。在葡萄糖添加72小時后拍攝照片，并與ng對照進行比較。四個亞組為a：asc ng；b: pmasc ng；c: asc hg；d: pmasc hg。
接下來，與hrpcs相比，進行了傷口愈合測定以評估不同asc亞組的細胞遷移能力（圖2 a）。數(shù)據(jù)顯示，在ng條件下培養(yǎng)時，ascs和pmascs在48小時的觀察期內(nèi)表現(xiàn)出顯著的遷移能力，傷口愈合率約為70%（圖2 b）。將葡萄糖加入培養(yǎng)基（hg）時觀察到顯著差異，與pmascs相比，ascs（傷口愈合率約為35%）明顯顯示出相反的趨勢。在傷口愈合率約為70% 的hrpcs 中觀察到中間值（圖2 c）。hg條件下，pmascs的相關(guān)細胞遷移能力在48小時時尤為明顯。
圖2 通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基（asc）或周細胞培養(yǎng)基（pmasc）中培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細胞以及人視網(wǎng)膜周細胞（hrpc）培養(yǎng)物中的傷口愈合測定評估細胞遷移能力。（a）在劃痕（0小時），培養(yǎng)24小時和48小時后每個樣品的代表性照片。量化asc和pm asc培養(yǎng)（b）和hrpc培養(yǎng)（c）的傷口愈合百分比。
然后評估了每個asc亞組和hrpc群的ros水平，在觀察期內(nèi)，asc種群中ros水平逐漸增加，而pmascs在每個相應(yīng)時間點檢測到穩(wěn)定且顯著降低的水平。加入葡萄糖后，每個asc組內(nèi)未觀察到明顯變化，而在hrpc培養(yǎng)組中觀察到不同的趨勢，72小時后觀察到其顯著更高的ros水平。
在進一步的實驗中，在ng和hg條件下，通過定量rt-pcr分析asc和pmasc培養(yǎng)物中炎癥相關(guān)細胞因子mrna水平（圖3）。在ng條件下培養(yǎng)時，ascs和pmascs之間的抗炎細胞因子il-10 mrna表達沒有明顯差異，而在hg條件下，asc培養(yǎng)物中略高的il-10 mrna水平在pmascs中增加了25倍。此外，與asc培養(yǎng)物相比，pmasc培養(yǎng)物中的tgf-β1 mrna水平升高，特別是在hg條件下。在ng條件下asc和pmasc培養(yǎng)物中檢測到相似的促炎細胞因子tnf-α mrna水平，而在hg條件下，與ascs中更顯著的增加相比，pmasc僅觀察到微弱升高的水平。與ascs相比，ng條件下的il-1β mrna水平在pmasc中顯著降低，而在hg培養(yǎng)中，ascs中測量的水平較低，而pmascs中沒有顯著差異。
此外，評估了血管生成因子vegf，血管生成素-2和mmp9的mrna表達水平。在hg培養(yǎng)的asc中，vegf和血管生成素-2值均增加，而在pmascs中的較低水平未受顯著影響。mmp9 mrna在ng條件下水平較低，添加葡萄糖后在ascs中顯著更高，在pmascs中甚至更低。這些數(shù)據(jù)表明，炎癥基因的調(diào)節(jié)有利于抗炎表型，同時，血管生成因子普遍降低。
圖3 高葡萄糖對在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（asc）或周細胞培養(yǎng)基（pmasc）中培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細胞中的抗炎和促炎細胞因子以及血管生成因子的影響。通過qrt-pcr評估il 10（a）、tgf-β1（b）、tnfα（c）、il-1β（d）、vegf（e）、血管生成素-2（f）和mmp9（g）mrna水平的定量分析。
最后，在3d共培養(yǎng)中測試了hrecs與ascs或pmascs之間的相互作用，分析了hrec自組裝的管狀結(jié)構(gòu)引起的修飾（圖4 a）。定量數(shù)據(jù)顯示，在hg與ng條件下，hrecs 的小管總主干長度值較低（圖4 b），與ascs共培養(yǎng)時也是如此，相反，與pmascs共培養(yǎng)的hrecs測量到更高的值。在hg與ng條件下，對于總分離分支長度（圖4 c）呈相反趨勢，hrecs和 hrecs + ascs 產(chǎn)生更高的值，而hrecs + pmascs的值明顯較低。圖4 d所示的分支點測量值與主干和分離分支長度值非常吻合。添加葡萄糖后，hrecs和hrecs + ascs共培養(yǎng)中的分支點數(shù)較低，hrecs + pmascs的共培養(yǎng)中分支點數(shù)較高。正如預(yù)期的那樣，分支點的數(shù)量隨著總主干長度值的增加而成比例增加，并且與總分離分支長度成反比。這可能表明，同樣在高葡萄糖條件下，周細胞樣ascs的存在會誘導(dǎo)更有組織的血管網(wǎng)絡(luò)。
圖4 高葡萄糖對人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞（hrec）或與ascs（hrec + asc）或pmascs（hrec + pmasc）共培養(yǎng)的管狀結(jié)構(gòu)形成的影響。（a）代表性顯微照片顯示了每個樣本的基質(zhì)膠中的3d培養(yǎng)物。底部的直方圖顯示total master segment length “總主干長度”（b）、total isolated branch length“總分離分支長度”（c）和branching points “分支點”（d）。
總之，這項工作獲得的結(jié)果令人鼓舞，因為即使在高葡萄糖濃度存在的情況下，周細胞樣ascs也具有顯著的活力，高增殖率和顯著的遷移能力。此外，觀察到ros，促炎細胞因子和促血管生成因子的產(chǎn)生減少，以及抗炎細胞因子的產(chǎn)生增加。最后，對hrec管狀形成結(jié)果觀察到了積極的影響，這些表明，特定的上游處理有助于優(yōu)化基于干細胞的治療應(yīng)用。當(dāng)這些周細胞樣ascs植入體內(nèi)時，這些在體外獲得的結(jié)果是否真的提供了有益的效果，還有待驗證。
參考文獻：mannino g, longo a, gennuso f, anfuso cd, lupo g, giurdanella g, giuffrida r, lo furno d. effects of high glucose concentration on pericyte-like differentiated human adipose-derived mesenchymal stem cells. int j mol sci. 2021 apr 27;22(9):4604. doi: 10.3390/ijms22094604. pmid: 33925714; pmcid: pmc8125146.
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