一、傳代前準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將無(wú)菌培養(yǎng)瓶、15ml離心管、移液管、槍頭等放入無(wú)菌超凈工作臺(tái)，紫外線照射30min，以進(jìn)行工作臺(tái)的消毒。
倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。
二、胰，蛋，白，酶/edta消化
從培養(yǎng)箱中取出待傳代的細(xì)胞，75%酒精進(jìn)行瓶口消毒，吸掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基。pbs緩沖液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，重復(fù)洗兩次。
棄去pbs,按每25平方厘米1ml消化液比例加入消化液，消化液中edta濃度視不同細(xì)胞而定，骨髓干細(xì)胞貼壁特性強(qiáng)，比較難于消化，可提高edta濃度的方法，本實(shí)驗(yàn)采用0.25%胰,蛋,白,酶加0.1%edta的消化液證明可以很好地消化，并不會(huì)損傷細(xì)胞。放入顯微鏡下觀察，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺(tái)內(nèi)，加入6ml細(xì)胞*培養(yǎng)基終止消化。消化時(shí)間為1~5分鐘，具體依細(xì)胞而異。
采用無(wú)菌吸管輕輕吹打細(xì)胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有細(xì)胞懸液放入一干凈的15ml離心管內(nèi)。每分鐘800轉(zhuǎn)，室溫離心5min。
三、制備細(xì)胞懸液及培養(yǎng)
吸棄上清液，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀。
向離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀加入適量*培養(yǎng)基。吹打混勻，吹打過(guò)程中盡量不要產(chǎn)生氣泡。
顯微鏡下觀察細(xì)胞分散情況，避免出現(xiàn)細(xì)胞成團(tuán)情況，確定為單細(xì)胞懸液方可進(jìn)行下一步操作。本實(shí)驗(yàn)以1:2的比例進(jìn)行分瓶，通常骨髓充間質(zhì)干細(xì)胞一般以1：3傳代，傳到第3代時(shí)，骨髓干細(xì)胞的純度可達(dá)95%以上。將培養(yǎng)瓶放入37°c，5％co2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
四、結(jié)果觀察
第二天可觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，細(xì)胞培養(yǎng)換液時(shí)間一般為2～3d，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)要求來(lái)確定。待細(xì)胞鋪滿器皿底面，即可使用，也可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)或換成維持液。懸浮細(xì)胞可以直接將培養(yǎng)瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養(yǎng)液即可。當(dāng)細(xì)胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺(jué)到比較臟時(shí)，可以將懸液移到離心管內(nèi)，1000～1500rpm離心3分鐘，棄上清，加入約2ml培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
五、注意事項(xiàng)
1、嚴(yán)格無(wú)菌：
傳代培養(yǎng)時(shí)要注意嚴(yán)格的無(wú)菌操作，并防止細(xì)胞之間的交叉污染。
2、適度消化：
消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，酶解消化過(guò)程中要不斷觀察，消化過(guò)度會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害，消化不夠則難于將細(xì)胞解離下來(lái)。對(duì)于貼壁能力較弱，容易脫壁的細(xì)胞，可以不經(jīng)蛋白酶原消化處理和終止消化這兩步，直接對(duì)原代培養(yǎng)物或經(jīng)漂洗后用吸管進(jìn)行吹打使細(xì)胞脫離瓶皿底壁。這種直接吹大的方法對(duì)生命力旺盛的細(xì)胞如某些腫瘤細(xì)胞較為合適。高強(qiáng)度機(jī)械吹打易對(duì)細(xì)胞造成傷害較大，細(xì)胞也常有較大數(shù)量的丟失，因而絕大部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞需消化后才能吹打，一般不單獨(dú)采用高強(qiáng)度機(jī)械吹打。
3、把握好消化液的最,佳濃度：
消化液的消化能力是和溶液的ph、溫度、胰,酶濃度及溶液中是否含有ca2+,mg2+和血清等因素有關(guān)，實(shí)驗(yàn)采用0.25%胰,蛋,白,酶+0.1%edta的消化液證明可以很好地消化骨髓干細(xì)胞。
4、吹打細(xì)胞動(dòng)作要輕柔：
吹打時(shí)用力過(guò)猛會(huì)損傷細(xì)胞?？蛇x擇用用大口徑的吸管或者管口較大的一次性耗材，減少對(duì)細(xì)胞的損傷。對(duì)貼壁細(xì)胞消化后的吹打過(guò)程要有序進(jìn)行，要從一邊開(kāi)始到另一邊結(jié)束，尤其是器皿的四角處，確保瓶皿底壁各處的細(xì)胞都被吹打脫離。
5、傳代次數(shù)不宜過(guò)多：
傳代數(shù)是指對(duì)培養(yǎng)物傳代的次數(shù)，它不等于細(xì)胞分裂的次數(shù)或細(xì)胞的代數(shù)，而僅代表傳代操作的次數(shù)。傳代對(duì)細(xì)胞的影響或傷害程度僅次于將活細(xì)胞從生物體內(nèi)取出并進(jìn)行原代培養(yǎng)的程度。只是因?yàn)閭鞔蟮募?xì)胞生長(zhǎng)并不像剛開(kāi)始原代培養(yǎng)時(shí)那樣緩慢。每經(jīng)過(guò)一次傳代，細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境就相應(yīng)發(fā)生一次較大變化。體外生長(zhǎng)的細(xì)胞若處于動(dòng)蕩的生活環(huán)境中，細(xì)胞的遺傳特性往往容易發(fā)生改變。經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，往往容易轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞。因此，傳代對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和性狀會(huì)產(chǎn)生不利影響，一般情況下要盡可能減少傳代次數(shù)。