a.dna模板：
·盡量使用高質(zhì)量、純化后的dna作為模板
·需要提高保真度時(shí)，可使用較高的dna模板濃度并減少循環(huán)數(shù)
·模板用量：以50 μl反應(yīng)體系為例——
人基因組dna：0.1~1.0 μg
大腸桿菌基因組dna：10~100 ng
lambdadna：0.5~5 ng
質(zhì)粒或病毒dna：0.1~10 ng
b.引物設(shè)計(jì)原則：
·引物長度要滿足特異性需要，一般可在18~25個(gè)堿基之間；擴(kuò)增長片段時(shí)最好在24~30個(gè)堿基之間；
·當(dāng)引入克隆位點(diǎn)時(shí)，引物末端應(yīng)額外增加3個(gè)以上堿基；
·(g+c)%含量應(yīng)盡量控制在40~60%，兩條引物的(g+c)%含量應(yīng)盡量接近；
·引物中g(shù)c堿基分布均勻；
·盡量避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)三次以上，3’端應(yīng)避免使用a或t；
·避免引物內(nèi)部自身配對形成二級結(jié)構(gòu)；
·正反向引物之間應(yīng)避免配對堿基，尤其是3’端的三個(gè)堿基，否則易生成引物二聚體(primer dimer)；
·兩條引物的解鏈溫度（tm）值應(yīng)在42~65℃之間，而且兩條引物間最好相差不超過5℃；
·引物tm值的計(jì)算方法：
20 nt以下：tm = 2℃x (a + t) + 4℃x (g + c)
20 nt以上：tm = 81.5 + 0.41 x (gc%) -600/nt(nt：引物的堿基數(shù))
·引物用量：
·0.1~1.0 μm，通?？梢?.2 μm起始，根據(jù)體系不同調(diào)整用量；
·使用簡并引物、隨機(jī)引物時(shí)，需增加引物總量以彌補(bǔ)產(chǎn)量損失；但隨著引物量加大，特異性將降低；
·模板較大較多，或結(jié)構(gòu)較復(fù)雜(如人基因組dna)時(shí)，需減少引物用量以提高特異性；
·模板較小較少(如質(zhì)粒模板)時(shí)，增加引物用量可提高產(chǎn)量。
c.核苷酸（dntps）：
·常規(guī)dntps濃度為每種核苷酸0.1~1.0 mm，通?？梢?.2 mm起始，根據(jù)體系不同調(diào)整用量；
·低濃度（0.05~0.1 mm）可增加保真性，但會(huì)降低產(chǎn)量；
·高濃度提高產(chǎn)量，尤其是長片段pcr，但會(huì)降低保真度。
d.鎂離子濃度
·對于taq dna聚合酶，鎂離子的最佳濃度為1.5~2.0 mm；
·最佳濃度取決于模板、緩沖液、dna和dntps（每一種都有可能鰲合鎂離子）；
·鎂離子濃度過低，會(huì)降低產(chǎn)量；
·鎂離子濃度過高，會(huì)增加非特異性pcr產(chǎn)物；
·優(yōu)化鎂離子濃度時(shí)，通常以0.5 mm梯度遞增，最高到4 mm。
e.taq dna聚合酶濃度
·推薦使用濃度為1~2.5 u/50μl反應(yīng)體系。
f.起始反應(yīng)
·在冰上配制反應(yīng)體系；
·最后加聚合酶；
·將熱循環(huán)儀預(yù)熱至變性溫度(94℃)后，放入pcr管，立即進(jìn)行反應(yīng)。
g.變性溫度與時(shí)間
·通常于94℃初始變性，使dna雙鏈全打開；
·變性時(shí)間通常為15~30秒；
·避免長時(shí)間或高溫度孵育；
·高gc含量模板可提高變性溫度至98℃。
h.退火溫度與時(shí)間
·通常情況下，退火溫度為引物tm值減5℃，在55~60℃之間；
·提高退火溫度有利于減少非特異性條帶；
·常規(guī)退火時(shí)間為15~30秒。
i.延伸溫度與時(shí)間
·延伸反應(yīng)通常在72℃下進(jìn)行。
·taq酶的延伸時(shí)間大約為15~30秒/kb dna；
·產(chǎn)物小于1 kb時(shí)，建議延伸時(shí)間為30~60秒；
·產(chǎn)物大于3 kb或反應(yīng)超過30個(gè)循環(huán)時(shí)，可能需要更長的延伸時(shí)間。
典型的循環(huán)條件：
預(yù)變形94℃2分鐘
94℃30秒，
55℃30秒，
72℃1分鐘/1 kb，25~30個(gè)循環(huán)
72℃5分鐘
注：上述反應(yīng)條件適用于普通taq dna聚合酶催化的pcr反應(yīng)。當(dāng)dna模板富含gc、具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)、低濃度或產(chǎn)物>5 kb時(shí)可能需要改變相應(yīng)條件