a.dna模板:
·盡量使用高質(zhì)量、純化后的dna作為模板
·需要提高保真度時(shí),可使用較高的dna模板濃度并減少循環(huán)數(shù)
·模板用量:以50 μl反應(yīng)體系為例——
人基因組dna:0.1~1.0 μg
大腸桿菌基因組dna:10~100 ng
lambdadna:0.5~5 ng
質(zhì)粒或病毒dna:0.1~10 ng
b.引物設(shè)計(jì)原則:
·引物長度要滿足特異性需要,一般可在18~25個(gè)堿基之間;擴(kuò)增長片段時(shí)最好在24~30個(gè)堿基之間;
·當(dāng)引入克隆位點(diǎn)時(shí),引物末端應(yīng)額外增加3個(gè)以上堿基;
·(g+c)%含量應(yīng)盡量控制在40~60%,兩條引物的(g+c)%含量應(yīng)盡量接近;
·引物中g(shù)c堿基分布均勻;
·盡量避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)三次以上,3’端應(yīng)避免使用a或t;
·避免引物內(nèi)部自身配對形成二級結(jié)構(gòu);
·正反向引物之間應(yīng)避免配對堿基,尤其是3’端的三個(gè)堿基,否則易生成引物二聚體(primer dimer);
·兩條引物的解鏈溫度(tm)值應(yīng)在42~65℃之間,而且兩條引物間最好相差不超過5℃;
·引物tm值的計(jì)算方法:
20 nt以下:tm = 2℃x (a + t) + 4℃x (g + c)
20 nt以上:tm = 81.5 + 0.41 x (gc%) -600/nt(nt:引物的堿基數(shù))
·引物用量:
·0.1~1.0 μm,通??梢?.2 μm起始,根據(jù)體系不同調(diào)整用量;
·使用簡并引物、隨機(jī)引物時(shí),需增加引物總量以彌補(bǔ)產(chǎn)量損失;但隨著引物量加大,特異性將降低;
·模板較大較多,或結(jié)構(gòu)較復(fù)雜(如人基因組dna)時(shí),需減少引物用量以提高特異性;
·模板較小較少(如質(zhì)粒模板)時(shí),增加引物用量可提高產(chǎn)量。
c.核苷酸(dntps):
·常規(guī)dntps濃度為每種核苷酸0.1~1.0 mm,通??梢?.2 mm起始,根據(jù)體系不同調(diào)整用量;
·低濃度(0.05~0.1 mm)可增加保真性,但會(huì)降低產(chǎn)量;
·高濃度提高產(chǎn)量,尤其是長片段pcr,但會(huì)降低保真度。
d.鎂離子濃度
·對于taq dna聚合酶,鎂離子的最佳濃度為1.5~2.0 mm;
·最佳濃度取決于模板、緩沖液、dna和dntps(每一種都有可能鰲合鎂離子);
·鎂離子濃度過低,會(huì)降低產(chǎn)量;
·鎂離子濃度過高,會(huì)增加非特異性pcr產(chǎn)物;
·優(yōu)化鎂離子濃度時(shí),通常以0.5 mm梯度遞增,最高到4 mm。
e.taq dna聚合酶濃度
·推薦使用濃度為1~2.5 u/50μl反應(yīng)體系。
f.起始反應(yīng)
·在冰上配制反應(yīng)體系;
·最后加聚合酶;
·將熱循環(huán)儀預(yù)熱至變性溫度(94℃)后,放入pcr管,立即進(jìn)行反應(yīng)。
g.變性溫度與時(shí)間
·通常于94℃初始變性,使dna雙鏈全打開;
·變性時(shí)間通常為15~30秒;
·避免長時(shí)間或高溫度孵育;
·高gc含量模板可提高變性溫度至98℃。
h.退火溫度與時(shí)間
·通常情況下,退火溫度為引物tm值減5℃,在55~60℃之間;
·提高退火溫度有利于減少非特異性條帶;
·常規(guī)退火時(shí)間為15~30秒。
i.延伸溫度與時(shí)間
·延伸反應(yīng)通常在72℃下進(jìn)行。
·taq酶的延伸時(shí)間大約為15~30秒/kb dna;
·產(chǎn)物小于1 kb時(shí),建議延伸時(shí)間為30~60秒;
·產(chǎn)物大于3 kb或反應(yīng)超過30個(gè)循環(huán)時(shí),可能需要更長的延伸時(shí)間。
典型的循環(huán)條件:
預(yù)變形94℃2分鐘
94℃30秒,
55℃30秒,
72℃1分鐘/1 kb,25~30個(gè)循環(huán)
72℃5分鐘
注:上述反應(yīng)條件適用于普通taq dna聚合酶催化的pcr反應(yīng)。當(dāng)dna模板富含gc、具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)、低濃度或產(chǎn)物>5 kb時(shí)可能需要改變相應(yīng)條件