什么是細(xì)胞培養(yǎng)？
有哪三種細(xì)胞培養(yǎng)？
細(xì)胞培養(yǎng)的條件是什么？
細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟是什么？
定義:細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。不論對(duì)于整個(gè)生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說，細(xì)胞培養(yǎng)都是一個(gè)*的過程，細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)模克隆。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞，這是克隆技術(shù)*的環(huán)節(jié)，而且細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的克隆。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù)，通過細(xì)胞培養(yǎng)既可以獲得大量細(xì)胞，又可以借此研究細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的合成代謝、細(xì)胞的生長增殖等。
細(xì)胞培養(yǎng)的分類：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)、微生物細(xì)胞培養(yǎng)
細(xì)胞培養(yǎng)的條件：
1．培養(yǎng)基
細(xì)胞培養(yǎng)基包含細(xì)胞生長所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，包括碳水化合物、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素等。針對(duì)不同細(xì)胞的營養(yǎng)需求，有多種合成培養(yǎng)基可供選擇，如ebss、eagle、mem、rpmll640、dmem等。
2．其他添加成分
在各種合成培養(yǎng)基提供基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)之外，還需根據(jù)不同細(xì)胞和不同的培養(yǎng)目的添加其他成分，如血清、因子等。
血清提供的是細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子和轉(zhuǎn)鐵蛋白等重要物質(zhì)，常用的是胎牛血清。要根據(jù)不同的細(xì)胞和不同的研究目的決定添加血清的比例。10%～20%的血清能維持細(xì)胞較快的生長增殖速度，稱為生長培養(yǎng)液；為維持細(xì)胞緩慢生長或不死，添加2%～5%的血清即可，稱為維持培養(yǎng)液。但血清中也存在有害于細(xì)胞生長和繁殖的物質(zhì)，如補(bǔ)體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子；成分不明確，影響對(duì)結(jié)果的分析；不同動(dòng)物、不同批次的血清活性差別較大，影響培養(yǎng)效果的穩(wěn)定性。
*是細(xì)胞生長重要的氮源，在細(xì)胞生長代謝過程中起重要作用，但由于*在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，故*需在使用前添加。
細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟：
一、細(xì)胞復(fù)蘇
將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移入15ml離心管中，加入10ml預(yù)熱的dmem*培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmx2min，棄上清液。加入10ml dmem培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10ml dmem*培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含5%co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
二、細(xì)胞傳代
細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)．去培養(yǎng)基，10ml pbs清洗2次。加入3ml含0．25%edta的*，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1ml dmem*培養(yǎng)基終止*消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml pbs清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmx2min，棄上清液。再加入10ml pbs（經(jīng)高壓滅菌，保存于40c），吹勻，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照1×105/盤接種，在含5%co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
三、細(xì)胞凍存
細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，去培養(yǎng)基，10ml pbs清洗2次。加入3ml含0.25%edta的*，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入lmldmem*培養(yǎng)基終止*消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml pbs清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmx2min，棄上清液。加入1ml凍存液（90%血清，10%dmso），放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內(nèi)，過夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放入液氮，可以保存三個(gè)月。
凍存液的配制：70%的*培養(yǎng)基+20%fbs+10%dmso.dmso要慢慢滴加，邊滴邊搖。