石蠟包埋組織mirna提取試劑盒的特點(diǎn)與注意事項(xiàng)！
本試劑盒用于快速?gòu)母栺R林固定、石蠟包埋組織樣品中提取rna包括microrna。的裂解液/蛋白酶k迅速裂解細(xì)胞釋放出rna，然后裂解混合物通過(guò)一個(gè)基因組dna清除柱，基因組dna被清除而rna穿透濾過(guò)。濾過(guò)的rna用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后,rna在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過(guò)一系列快速的漂洗-離心的步驟,去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的rnase free h20將純凈rna從硅基質(zhì)膜上洗脫。得到的rna可用于反轉(zhuǎn)錄pcr、熒光定量pcr等實(shí)驗(yàn)。
產(chǎn)品組分：
裂解液——————15ml
結(jié)合液——————25 ml
漂洗液——————10ml
蛋白酶k——————20mg（可選）
rnase-free h2o——————10ml
基因組dna清除柱和收集管——————50套
rna吸附柱和收集管室溫——————50套
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1、不使用有毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
2、快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品rna提取操作一般可在1小時(shí)內(nèi)完成。
3、試劑盒的基因組清除柱和配方確保有效清除基因組dna殘留，一般情況下得到的rna不需要dnase消化，可直接用于反轉(zhuǎn)錄pcr、熒光定量pcr等實(shí)驗(yàn)。
4、多次柱漂洗確保rna高純度，可直接用于下游各種實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)：
1、所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如eppendorf 5415c 或者類(lèi)似離心機(jī)。
2、樣品處理量不要超過(guò)基因組dna清除柱和rna吸附柱處理能力，否則造成dna殘留或者產(chǎn)量降低。不同組織細(xì)胞種類(lèi)rna/dna相差極大，例如胸腺脾臟dna含量豐富，超過(guò)5mg就會(huì)超過(guò)柱子處理能力。cos細(xì)胞rna含量豐富，超過(guò)3x106細(xì)胞就會(huì)超過(guò)柱子吸附能力。所以開(kāi)始摸索實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，如果不清楚樣品dna/rna含量時(shí)寧可使用較少的樣品處理量，如不超過(guò)2個(gè)10μm厚度石蠟切片。將來(lái)根據(jù)樣品試驗(yàn)情況增加或者減少處理量。
3、裂解液pkd、結(jié)合液rbc中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
4、預(yù)防rnase 污染，應(yīng)注意以下幾方面：
1)經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌，可能導(dǎo)致rnase 污染。
2)使用無(wú)rnase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染。
3)rna提取過(guò)程中應(yīng)使用不含rnase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5 m naoh 中浸泡10 分鐘，然后用水清洗，再滅菌，即可去除rnase。
4)配制溶液應(yīng)使用無(wú)rnase 的水。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入depc 至終濃度0.1%( v/v)，37℃放置過(guò)夜，高壓滅菌。）
5、關(guān)于dna 的微量殘留：
一般說(shuō)來(lái)任何總rna 提取試劑在提取過(guò)程中無(wú)法避免dna 的微量殘留（dnase 消化也無(wú)法做到無(wú)殘留），本試劑盒采取了本公司的緩沖體系和基因組dna 清除柱技術(shù)，絕大多數(shù)dna 已經(jīng)被清除，可直接用于反轉(zhuǎn)錄pcr 和熒光定量pcr。個(gè)別特殊情況如dna 含量過(guò)于豐富造成殘留或者要進(jìn)行嚴(yán)格的mrna 表達(dá)量分析熒光定量pcr，我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時(shí)：
1)選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過(guò)mrna 中的連接區(qū),這樣dna 就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。
2)選擇基因組dna 和cdna 上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對(duì)。
6、rna 純度及濃度檢測(cè)：
完整性：rna 可用普通瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件：膠濃度1.2%；0.5×tbe 電泳緩沖液；150v，15 分鐘)檢測(cè)完整性。由于石蠟包埋組織福爾馬林固定和包埋過(guò)程中一般由于rna 與蛋白反應(yīng)交聯(lián)會(huì)導(dǎo)致rna 斷裂或者降解，一般電泳后uv下只能看到模糊彌散（smear）帶型，隨著儲(chǔ)存的時(shí)間越長(zhǎng)，降解斷裂越嚴(yán)重，甚至只能看到峰值僅僅在100bp 左右的模糊條帶。這都屬于rna 提取正常情況。
純度：od260/od280 比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的參考指標(biāo)。高質(zhì)量的rna，od260/od280 讀數(shù)（10mmtris, ph7.5）在1.8-2.1 之間。od260/od280 讀數(shù)受測(cè)定所用溶液的ph 值影響。同一個(gè)rna 樣品，假定在10mm tris，ph7.5 溶液中測(cè)出的od260/od280 讀數(shù)1.8-2.1 之間，在水溶液中所測(cè)讀數(shù)則可能在1.5-1.9之間，但這并不表示rna不純。
濃度：取一定量的rna 提取物，用rnase-free 水稀釋n 倍，用rnase-free 水將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行od260, od280 測(cè)定，按照以下公式進(jìn)行rna濃度的計(jì)算：終濃度（ng/μl）= (od260)×(稀釋倍數(shù)n)×40。
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