蛋白marker即蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，是一些已知分子量的蛋白質(zhì)的混合物，像“尺子”一樣用來指示蛋白質(zhì)條帶的大小。
在western blot過程中，分子量marker就像個(gè)螺絲釘一樣雖然是其中小小的一環(huán)，然而就是這樣一個(gè)小細(xì)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著不可忽視的作用。marker的作用主要是用來指示蛋白條帶所對(duì)應(yīng)的分子量大小，只有標(biāo)準(zhǔn)量精確無誤了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有說服力，除此之外，蛋白marker還有顯示轉(zhuǎn)膜是否成功、以及蛋白在凝膠上的電泳程度等作用，因此選擇正確的蛋白marker也是western blot實(shí)驗(yàn)成功的必要條件之一。我們整理了一些在實(shí)驗(yàn)中蛋白marker的常見問題，快來學(xué)習(xí)吧！
一、marker一定要都跑出來嗎？
比如說說明書上市7條帶，其實(shí)跑出6條帶是正常的,可能是跑的時(shí)間不夠,如果你的蛋白不是很小的話,可以等溴酚藍(lán)前沿剛跑出膠的時(shí)候再關(guān)電泳儀,這樣應(yīng)該可以有7條帶.有的時(shí)候還會(huì)跑出5條,不過只要在你的目的蛋白的上下兩個(gè)帶都跑出來了就可以了,不一定非要7條。
二、marker變成笑臉狀怎么辦？
第一，膠沒有壓片
第二，膠在板的邊緣與中心的膠的流動(dòng)性可能不同，這個(gè)沒有辦法，跟黏度和表面張力有關(guān)。如果各種方法都不能解決上面的現(xiàn)象，個(gè)人建議maker換一條道上樣，選一條靠近中間的泳道跑一跑。
邊緣效應(yīng)，在邊緣兩個(gè)泳道的樣品會(huì)這樣的?？梢栽囋囯娪舅俣嚷c(diǎn)兒......
要么配膠時(shí)沒壓好，膠沒配好，要么電泳時(shí)電壓太大，電滲力強(qiáng)，要么玻板電泳時(shí)沒夾好，內(nèi)電泳液是漏的，請(qǐng)逐一排查。
三、marker條帶變寬怎么解決？
原因一：上樣量過多，應(yīng)該減少上樣量。
對(duì)策：加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15μl（即2-10μg蛋白質(zhì)）。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到100μl。
原因二：樣品溶解不wan全。
對(duì)策：
(1)樣品應(yīng)該充分溶解：保持各種蛋白質(zhì)樣品和marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好離心一下，實(shí)在溶解不掉的顆粒就去掉。
(2)可以根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)試劑盒的要求加入樣品溶解液；如果是自行配置標(biāo)準(zhǔn)和未知樣品，按照0.5-1.0mg/l樣品溶解液。溶解后，將其轉(zhuǎn)移至ep管，蓋上蓋子（可以在蓋子處加上卡子）后在110度沸水中水浴加熱3分鐘（可以在薄泡沫塑料板上鉆出幾個(gè)與ep管直徑形同的圓洞，ep管放下去直到蓋子邊緣約束不能再往下為止，把薄泡沫塑料板的暴露出ep管的管體大部分的那一面放入沸水浴鍋中，薄泡沫塑料板自然飄在沸水表面，便于取用和加熱，也可避免沸水濺起。
可以一批對(duì)于多個(gè)ep管進(jìn)行不同時(shí)間的沸水浴。不要把ep管扔進(jìn)沸水浴鍋中，蓋子可能會(huì)被沖開），而后在室溫下冷卻待用。如果較長時(shí)間不用，則將樣品放入零下20度冰箱中儲(chǔ)存，需用時(shí)在取出后使用前在110度沸水中加熱3分鐘室溫冷卻后再上樣，以去掉樣品蛋白質(zhì)中的亞穩(wěn)態(tài)聚合體。
(3)改變樣品緩沖溶液使得樣品能夠充分溶解，sds 用量要充分。
原因：sds電泳帶與鄰近蛋白質(zhì)電泳相連。除了上樣量過多和樣品溶解不wan全外，凝膠的加樣孔泄露會(huì)使得電泳帶變寬。加樣孔泄露往往由于凝膠與玻璃板之間產(chǎn)生裂紋引起。對(duì)策：此時(shí)只能重新制備凝膠，梳子拔起時(shí)要小心等凝膠凝聚完畢，速度不宜過快，拔起的方向要垂直于凝膠表面；要避免凝膠兩側(cè)的玻璃板與凝膠之間產(chǎn)生裂紋，在凝膠制備過程中不要擠壓凝膠兩側(cè)的玻璃板。
本期內(nèi)容：蛋白marker的常見問題解答
下期內(nèi)容：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞你知多少？