摘要 ：本文基于固相微萃取和氣相色譜質(zhì)譜 (spme-gc/ms) 非靶向測定蜂蜜中揮發(fā)性組分， 結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法建立了不同植物來源蜂蜜判別和預(yù)測的方法。利用 spme-gc/ms 對來自四種植物來源（包括洋槐蜜、椴樹蜜、荊條蜜和油菜蜜）的 87 個真實(shí)蜂蜜樣 品中的全譜揮發(fā)性化合物進(jìn)行非靶向分析。通過主成分分析 (pca) 對樣品進(jìn)行質(zhì)量控 制。然后，建立基于偏小二乘判別分析 (pls-da)、樸素貝葉斯 (nb) 和誤差反向傳 播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (bp-ann) 的樣品分類預(yù)測模型。模型的準(zhǔn)確率為 100%，這表明不 同植物來源蜂蜜可以準(zhǔn)確分類。此外，還通過另外一組獨(dú)立的 20 個真實(shí)蜂蜜樣品， 對模型的可靠性和實(shí)用性進(jìn)行了驗(yàn)證。所有 20 個樣品均得到準(zhǔn)確分類。后，對椴 樹蜜的特征揮發(fā)性化合物進(jìn)行初步鑒定。這表明，本研究建立的不同植物來源蜂蜜 判別方法是準(zhǔn)確、可靠的，同時有助于尋找蜂蜜中的特征化合物。
前言： 蜂蜜以其營養(yǎng)和藥用特性成為了世界上受歡迎的天然產(chǎn)物之一。蜂蜜的植物來源 和產(chǎn)地受到消費(fèi)者的日益關(guān)注。蜂蜜的價 格通常與其植物來源/產(chǎn)地有關(guān)。因此， 很有必要開發(fā)一種快速強(qiáng)大的方法來鑒定 不同來源的蜂蜜。gc/ms 在識別和定量 分析復(fù)雜樣品中的有機(jī)化合物方面具有優(yōu) 勢，與固相微萃取 (spme) 的組合可用于 分析蜂蜜中的揮發(fā)性化合物[1]。 本應(yīng)用簡報介紹了近發(fā)表的一項關(guān)于非 靶向揮發(fā)性化合物圖譜的研究[2]，該研究 結(jié)合使用 spme 和 gc/ms 與化學(xué)計量學(xué) 方法，對中國蜂蜜的植物來源進(jìn)行分類。 該研究開發(fā)出一種基于非特異性揮發(fā)性化 合物指紋圖譜和多變量分析分類并預(yù)測蜂 蜜植物來源的方法。應(yīng)用 spme-gc/ms 在全掃描模式下非靶向采集蜂蜜的全譜揮 發(fā)性化合物數(shù)據(jù)。使用各種過濾參數(shù)進(jìn)行 多變量優(yōu)化。然后，建立基于偏小二乘 判別分析 (pls-da)、樸素貝葉斯 (nb) 和 誤差反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (bp-ann) 的 預(yù)測模型。對于具有顯著性差異的 化合物進(jìn)行了初步確認(rèn)
材料與方法 ：蜂蜜樣品 87 個真實(shí)蜂蜜樣品，包括 19 個洋槐 (robiniapseudoacacia l.) 蜜樣品、22 個 椴樹 (tilia amurensis rupr.) 蜜樣品、 22 個荊條 (vitexnegundo var. heterophyllarehd.) 蜜樣品和 24 個油菜 (brassica campestris l.) 蜜樣品，分別采 集自中國北京、吉林、河北和陜西。從養(yǎng) 蜂人處直接采集 500 g 以上的各種蜂蜜樣 品，并保存在 4 °c 的冰箱中待分析。 固相微萃取 使用 ctc 自動進(jìn)樣系統(tǒng)和 2 cm 涂有 50/30 µm 二乙烯苯/carboxen/聚二甲 基硅氧烷 (dvb/car/pdms) 的纖維頭 （部件號su57348u）運(yùn)行 spme 程序。 分析前，將纖維置于氣相色譜進(jìn)樣口中， 在 270 °c 下老化 1 小時。spme 條件如 下：將 3 g 蜂蜜放入包含 1.5 ml 去離子 水和 0.5 g 氯化鈉的 20 ml 頂空螺紋口樣 品瓶（部件號 5183-4474）中，并用聚四 氟乙烯 (ptfe)/硅橡膠隔墊（部件號 5183- 4477）將樣品瓶密封。然后在 80 °c 下， 將涂有 dvb/car/pdms 的纖維頭置于樣 品溶液的頂部空氣中暴露 30 分鐘。完成 萃取步驟后，將纖維頭從樣品瓶中取出并 插入氣相色譜進(jìn)樣口中，在 250 °c 下進(jìn) 行 2 分鐘熱脫附。 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析 利用 agilent masshunter gc/ms 轉(zhuǎn)換軟 件 b.07.00 版將 agilent chemstation 數(shù) 據(jù)轉(zhuǎn)換為 masshunter 數(shù)據(jù)。將轉(zhuǎn)換后的 gc/ms 數(shù)據(jù)導(dǎo)入 masshunter 未知物分析 軟件（b.07.01 版）中，并根據(jù)未知物分 析的優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行解卷積和鑒定。將處理 后的蜂蜜樣品輪廓圖導(dǎo)出為 cef 文件，然 后導(dǎo)入 agilent mass profiler professional （13.0 版）中。 采用化學(xué)計量學(xué)方法，例如主成分分析 (pca)、單因素方差分析 (anova) 和預(yù)測 模型（包括 pls-da、nb 和 bp-ann）。 圖 1. 本研究所用的部分蜂蜜樣品 化學(xué)品 己烷（ms 級）購自 fisher scientific（中 國上海）。正己烷購自 sigma-aldrich，并 采用一系列烷烴 (c8h18–c25h52) 計算保留 指數(shù)。利用癸酸甲酯 (sigma-aldrich) 作 為內(nèi)標(biāo)。實(shí)驗(yàn)用水產(chǎn)自 milli-q 水純化系 統(tǒng) (millipore, bedford, ma, us
結(jié)果與討論： 數(shù)據(jù)挖掘 使用 agilentmpp 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾和化 學(xué)計量學(xué)分析。對所有 cef 文件進(jìn)行數(shù)據(jù) 過濾。對于四組樣品，通過數(shù)據(jù)匹配總共 獲得了 2734 個化合物。根據(jù) mpp 工作 流程，第yi個過濾器是按標(biāo)記進(jìn)行過濾， 該步驟用于消除不可靠的化合物。根據(jù) 各個樣品是否高于閾值或達(dá)到飽和設(shè)置 “存在”和“臨界”標(biāo)志，以從整個數(shù)據(jù) 集中過濾化合物。保留了 87 個樣品中至 少 2 個樣品中可接受的化合物。第二個 過濾器是按頻率過濾，根據(jù)化合物在樣 品中的出現(xiàn)頻率對其進(jìn)行過濾。在該步 驟中，必須是存在的化合物才可進(jìn)行該 步過濾。這些過濾條件保留了每個樣品 中在至少一種條件中出現(xiàn)的化合物。第 三個過濾器是顯著性分析，根據(jù)單因素 方差分析計算出的 p 值。為確保僅保留 存在顯著差異的化合物，在大多數(shù)情況 下，選擇的 p 值截止值為 0.05。經(jīng)過三 個過濾步驟，將化合物數(shù)量從 2734 減少 至 114。為鑒定處理樣品和對照樣品之間 的豐度比或差異超出給定倍數(shù)變化截止值 或閾值的化合物，采用倍數(shù)變化分析作 為終過濾步驟。當(dāng)倍數(shù)變化截止值為 2 時，保留了 110 個化合物，表明一系列 過濾步驟顯著減少了變量數(shù)量和數(shù)據(jù)集的 維數(shù)。
主成分分析 pca 是常用的無監(jiān)督的統(tǒng)計方法，可 以對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，消除眾多復(fù)雜 信息中重疊的部分，盡可能地用少數(shù)變 量來解釋數(shù)據(jù)中的大部分信息。根據(jù)先 前的過濾結(jié)果，將 pca 應(yīng)用于四個植物 來源的 87 個蜂蜜樣品，以分析其自然分 組。一般而言，如果前四個 pc 能夠解釋總變量的 75%，則認(rèn)為模型是準(zhǔn)確可靠 的。[3] 有必要進(jìn)一步選擇并減少前文提及 的變量，從而提高模型的可靠性。倍數(shù) 變化截止值可根據(jù)上述過濾步驟進(jìn)行優(yōu) 化。將 pc1-pc4 解釋的總變化視為評估 標(biāo)準(zhǔn)，選擇的倍數(shù)變化截止值為 200。圖 2 顯示了倍數(shù)變化截止值為 200 的蜂蜜樣 品的得分圖。椴樹蜜樣品位于第yi主成分 (pc1) 的右側(cè)，而其他三種類型的蜂蜜位于 pc1 的左側(cè)。因此，pc1 將蜂蜜樣品 清楚地分為椴樹蜜和非椴樹蜜。椴樹蜜和 油菜蜜樣品均具有正 pc2，而荊條蜜和 洋槐蜜樣品均具有負(fù) pc2。pc1 和 pc2 分別占方差的 35.35% 和 25.38%，且前 四個 pc 占總變量的 79.12%。因此，選 擇 200 作為倍數(shù)變化截至值，同時將這 70 個保留下來的化合物作為變量用于模 型建立。
模型建立與預(yù)測 pca 結(jié)果表明，過濾后的數(shù)據(jù)可用于區(qū)分 蜂蜜樣品的植物來源。以上述 70 個化合物 為變量，應(yīng)用化學(xué)計量學(xué)方法建立溯源模 型，用于對各種來源的蜂蜜進(jìn)行分類和預(yù) 測。本研究基于 87個真實(shí)蜂蜜樣品（包括 19 個洋槐蜜樣品、22 個椴樹蜜樣品、 24 個油菜蜜樣品和 22個荊條蜜樣品）建 立了三種分類模型，即 pls-da、nb 和 bp-ann。模型訓(xùn)練和驗(yàn)證過程中正確分 類蜂蜜樣品的百分比證明了這些模型的識 別和預(yù)測能力。表2 列出了這三種模型的 準(zhǔn)確度，100% 的蜂蜜樣品得到準(zhǔn)確分類。 盡管模型訓(xùn)練中的識別能力和模型交叉 驗(yàn)證中的預(yù)測能力為 100%，但采用原始 87 個真實(shí)蜂蜜樣品中不包括的樣品對建立 的模型進(jìn)行驗(yàn)證仍然*。因此，將 另外 20 個未包括在統(tǒng)計模型開發(fā)過程中的 真實(shí)蜂蜜樣品（包括每種植物來源各 5 個 蜂蜜樣品）作為測試集進(jìn)行分析。表 3 列 出了預(yù)測結(jié)果和置信度。所有 20 個真實(shí) 蜂蜜樣品均得到正確預(yù)測。盡管預(yù)測組 與實(shí)際組一致，但對于 pls-da、nb 和 bp-ann 模型，置信度的值有所不同。
揮發(fā)性化合物標(biāo)記物的鑒定 利用維恩圖對不同植物來源蜂蜜在預(yù)測模 型中的化合物列表進(jìn)行確認(rèn)。圖 3 顯示了 各種植物來源的化合物列表和交叉情況。 洋槐蜜、荊條蜜、椴樹蜜和油菜蜜的化合 物列表分別包含 50、43、52 和 47 個化 合物。由于椴樹蜜在質(zhì)量和價格上均優(yōu)于 其他蜂蜜，因此標(biāo)記物鑒定的重點(diǎn)放在 在椴樹蜜樣品中發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)性化合物。 圖3 顯示了初步選擇的僅出現(xiàn)在椴樹蜜 中的八種揮發(fā)性化合物。通過 nist 對它 們進(jìn)行初步鑒定。表 4 列出了它們的保 留時間、保留指數(shù)、離子和參考文獻(xiàn)。 除戊酸、2-甲酸酐外，椴樹蜜中的所有 其他化合物均在參考文獻(xiàn)中有報道[5-8]。 其中，blank 等人提出將順式玫瑰醚作為 椴樹蜜的指示劑[6]。blank 還從椴樹 (tilia cordata) 花中發(fā)現(xiàn)了這種化合物，但在其 他類型的蜂蜜中并未發(fā)現(xiàn)[6]。盡管缺少有 關(guān)椴樹花中揮發(fā)性化合物的文獻(xiàn)報道，但 表 4 列出的化合物也被初步視為椴樹蜜 的標(biāo)記化合物。這些化合物在區(qū)分椴樹蜜 與其他蜂蜜方面有重要意義。
結(jié)論 本研究成功應(yīng)用了基于 spme 和非靶 向 gc/ms 分析與化學(xué)計量學(xué)方法結(jié)合的 分類方法來區(qū)分各種植物來源的蜂蜜樣 品?；?87 個真實(shí)蜂蜜樣品建立了三種 分類模型，即 pls-da、nb 和 bp-ann， 模型準(zhǔn)確度為 100%。另外 20 個真實(shí)蜂 蜜樣品的預(yù)測結(jié)果表明，所開發(fā)的模型實(shí) 用而可靠。因此，spme-gc/ms 測定非 特異性輪廓結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法在不同植 物來源分類和判別方面具有廣闊的應(yīng)用 前景。