gel ning jiao
又稱凍膠。溶膠或溶液中的膠體粒子或高分子在一定條件下互相連接，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)空隙中充滿了作為分散介質(zhì)的液體（在干凝膠中也可以是氣體），這樣一種特殊的分散體系稱作凝膠。沒(méi)有流動(dòng)性。內(nèi)部常含有大量液體。例如血凝膠、瓊脂的含水量都可達(dá)99%以上?？煞譃閺椥阅z和脆性凝膠。彈性凝膠失去分散介質(zhì)后，體積顯著縮小，而當(dāng)重新吸收分散介質(zhì)時(shí)，體積又重新膨脹，例如明膠等。脆性凝膠失去或重新吸收分散介質(zhì)時(shí)，形狀和體積都不改變，例如硅膠等。由溶液或溶膠形成凝膠的過(guò)程稱為膠凝作用（gelation）。生物學(xué)和凝膠生物分子下游純化的對(duì)象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測(cè)定生物分子的各物理和化學(xué)特性，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇出最有效的純化流程。
1.測(cè)定——分子量、pi
當(dāng)目標(biāo)蛋白的物理特性如分子量、pi等都不清楚時(shí)，可用page電泳方法或?qū)游龇椒右詼y(cè)定。分離范圍廣闊的superose hr預(yù)裝柱很適合測(cè)定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質(zhì)在多個(gè)含不同ph緩沖液的試管中，可簡(jiǎn)易地測(cè)出pi，并選擇純化用緩沖液的最佳ph.
2.選擇——層析方法
若對(duì)目標(biāo)蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：
一] 使用最通用的凝膠過(guò)濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質(zhì)如superose、sephacryl hr依據(jù)分子量將 樣品分成不同組份。
二] 用含專一配體或抗體的親和層析介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)蛋白。亦可用各種活化偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)目標(biāo)蛋白的底物、受體等自制親和介質(zhì)，再用以結(jié)合目標(biāo)蛋白。一步即可得到高純度樣品。
三] 體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。
3.純化——大量粗品
處理大量原液時(shí)，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharosexl、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質(zhì)。擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)利用多種streamline介質(zhì)，直接從含破碎細(xì)胞或組織萃取物的發(fā)酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結(jié)合為一。提高回收率，縮短純化周期。
4.純化——硫酸氨樣品 硫酸氨沉淀方法常被用來(lái)初步凈化樣品，經(jīng)處理過(guò)的樣本處于高鹽狀態(tài)下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用sephadex g-25脫鹽。疏水層析是較新技術(shù)，隨著介質(zhì)種類不斷增多，漸被融入各生產(chǎn)工藝中。利用hitrap hic test kit 和resource hic test kit可在八種疏水介質(zhì)中選擇最適合介質(zhì)及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。
5.純水——糖類分子
固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可結(jié)合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細(xì)胞膜組份、細(xì)胞、甚至亞細(xì)胞細(xì)胞器，純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的sepharose 6mb親和層析介質(zhì)，專為俘獲整個(gè)細(xì)胞或大復(fù)合物，如膜囊等。
6.純化——膜蛋白
膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應(yīng)選用與目標(biāo)蛋白相反電荷者，避免在作離子交換時(shí)和目標(biāo)蛋白競(jìng)爭(zhēng)交換介質(zhì)，籍此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。
7.純化——單抗、抗原 *單抗多為igg.來(lái)源主要是腹水和融合瘤培養(yǎng)上清液。腹水有大量白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和宿主抗體等。mabselect、protein g和protein a對(duì)igg的fc區(qū)有專一性親和作用，能一步純化各種不同源的igg.血清互補(bǔ)劑如小牛血清可先用蛋白g預(yù)處理，在培養(yǎng)前除去igg.重組蛋白a介質(zhì)mabselect和rprotein a sepharose ff對(duì)igg有更高的載量和專一性，基團(tuán)脫落更少。脫落的rprotein a用離子交換q sepharose hp或凝膠過(guò)濾superdex 200，很容易去除。
*疏水層析phenyl sepharose hp亦很適合純化igg.宿主抗體和污染igg可用凝膠過(guò)濾superdex 200在精細(xì)純化中去除。
*純化igg抗原最有效的方法是用活化偶聯(lián)介質(zhì)如cnbr、nhs activated sepharose ff偶聯(lián)igg，再進(jìn)一步獲取igg抗原。
*hitrap igm是用來(lái)純化融合瘤細(xì)胞培養(yǎng)的單抗igm，結(jié)合量達(dá)5mg igm.hitrap igy是專門(mén)用來(lái)純化igy，結(jié)合量達(dá)100mg純igy.
8.純化——重組蛋白 重組蛋白在設(shè)計(jì)、構(gòu)建時(shí)應(yīng)已融入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細(xì)胞或溶解產(chǎn)物，擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)streamline便很適合做粗分離。amersham biosciences提供三個(gè)快速表達(dá)、一步純化的融合系統(tǒng)。
一] gst融合載體使要表達(dá)的蛋白和谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用glutathione sepharose 4b作親和層析純化，再利用凝血酶或因子xa切開(kāi)。
2. 蛋白a融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白a的igg結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以igg sepharose 6 ff純化。
二] 含組氨酸標(biāo)記（histidine-tagged）的融合蛋白可用chelating sepharose ff螯合ni2+金屬，在一般或變性條件（8m尿素）下透過(guò)組氨酸螯合融合蛋白。histrap試劑盒提供整套his-tag蛋白的純化方法。
9.純化——包涵體蛋白
包涵體蛋白往往需溶于6m鹽酸胍或8m尿素中。高化學(xué)穩(wěn)定性的superose 12及sepharose 6ff凝膠過(guò)濾介質(zhì)很適合在變性條件下做純化。變性純化后的蛋白需要復(fù)性至蛋白的天然構(gòu)象。superdex 75、q sepharose ff和phenyl sepharose ff分別被發(fā)現(xiàn)有助包涵體蛋白的復(fù)性。一般包涵體蛋白樣品的純度越高，復(fù)性效果越好。source 30 rpc反相層析介質(zhì)很適合純化復(fù)性前的粗品，并可以1mnaoh重生。此方法純化后的包涵體蛋白，復(fù)性回收率明顯提高。
10.包涵體蛋白固相復(fù)性 *近年許多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質(zhì)上，一般用各種sepharose ff離子交換層析介質(zhì)。去除變性劑后，蛋白在介質(zhì)上成功復(fù)性，再將復(fù)性好的蛋白洗脫下來(lái)。固相復(fù)性避免了一般復(fù)性過(guò)程中蛋白質(zhì)聚體的形成，所以復(fù)性得率更高，而且無(wú)需大量稀釋樣品，并將復(fù)性和初純化合二為一，大大節(jié)省時(shí)間及提高回收率。
*固相復(fù)性方法也被用于以hitrap chelating金屬螯合層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達(dá)的組氨酸融合蛋白；以hitrap heparin肝素親和層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達(dá)的含多個(gè)賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預(yù)裝柱均可反復(fù)多次重復(fù)使用，比一般試劑盒更方便、耐用。
11.純化——中草藥有效成分
中藥的化學(xué)成分極其復(fù)雜。傳統(tǒng)中藥多是煎熬后服用，有效成份多較為親水，包括生物堿、黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸、多糖、肽和蛋白質(zhì)。靈活及綜合性地利用多種層析方法。如離子交換、分子篩、反相層析，更容易分離到單一活性成分。sephadex lh-20葡聚糖凝膠同時(shí)具備吸附性層析和分子篩功能，例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來(lái)，二糖甙其次，單糖甙隨后，最后是甙元。sephadex lh-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離，包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內(nèi)脂、萜類、甾類等。
*生物堿在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，hitrap sp陽(yáng)離子交換層析柱可以分離許多結(jié)構(gòu)非常近似的生物堿。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸等可溶于偏堿的緩沖液中，在hitrap q陰離子交換柱上分離效果良好。
*一般多糖純化大多使用分子篩如sephadex，sephacryl.若分子量在600kd以下，并需更高分辨率，可選擇新一代的superdex.一般植物可能含水溶性、酸溶性、堿溶性多種多糖。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進(jìn)一步獲各組份純品。另外，多糖藥物需去除可引起過(guò)敏的蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)sevag方法用丁醇脫蛋白需反復(fù)數(shù)十次。陰陽(yáng)離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質(zhì)。source5、15、30rpc反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測(cè)、分離和放大制備。由于中藥的成分非常復(fù)雜，source反相層析可用范圍為ph1-14 ，并可用1m naoh，1m hcl清洗、再生。比傳統(tǒng)硅膠反相層析更易于工藝優(yōu)化及在位清洗，壽命也更長(zhǎng)。
12.純化——肽類
肽類的來(lái)源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可從有機(jī)溶劑或促溶劑中復(fù)性，所以多以高選擇性的反相層析如source 30rpc、source 15rpc、source 5rpc或離子交換minibeads、monobeads作純化。superdex peptide hr是專為肽分子純化設(shè)計(jì)的凝膠過(guò)濾預(yù)裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過(guò)濾superdex 30 pg。醫(yī)學(xué)都市多功能
13.純化——核酸、病毒
核酸的純化用于去除影響測(cè)序或pcr污染物等研究。核酸可大致上分為質(zhì)粒dna、噬菌體dna和pcr產(chǎn)物等。病毒也可視作核酸大分子，和質(zhì)粒dna一樣，可用分離大