簡介
dapi（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）是一種熒光染料，常用于核dna 染色。它用于熒光顯微鏡、染色體擴(kuò)散、facs 和細(xì)胞檢測等成像實(shí)驗(yàn)【1-4】。然而，紫外光激發(fā)會導(dǎo)致dapi 的光轉(zhuǎn)換，從而在成像系統(tǒng)的fitc/gfp 通道中檢測dapi 熒光，從而導(dǎo)致結(jié)果解釋錯誤【5，6】。dapi 還需要固定細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)染色。在這個亮點(diǎn)中，我們展示了dapi 染色的一些替代方法，包括stainfree 技術(shù)，該技術(shù)不需要染色，并且可與活細(xì)胞一起使用。
molecular devices spectramax® i3 多功能微孔板酶標(biāo)儀采用spectramax® minimax 300 成像細(xì)胞計數(shù)儀，使用stainfree 細(xì)胞檢測技術(shù)來定量細(xì)胞。這種非標(biāo)記方法使用透射光成像和復(fù)雜的軟件來識別單個細(xì)胞或細(xì)胞群。用戶可以“教導(dǎo)”軟件通過監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)算法來識別細(xì)胞。這使得科學(xué)家能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行計數(shù)并監(jiān)測細(xì)胞生長，而不會在昂貴的染色程序中損害細(xì)胞或損失時間和金錢。
dapi 的另一種替代方法是molecular devices earlytox 活細(xì)胞紅色染料。這種細(xì)胞滲透性紅色熒光染料可對培養(yǎng)物中所有細(xì)胞的核dna 進(jìn)行染色，無論其活性如何，并可在需要核染色的成像檢測中用作dapi 的替代物。在622 nm 激發(fā)和645 nm 峰值發(fā)射的情況下，活的紅色染料在成像檢測中不會干擾fitc 通道。
我們進(jìn)行了一項細(xì)胞計數(shù)實(shí)驗(yàn)，以證明stainfree 技術(shù)和活細(xì)胞紅色染料方法與dapi 染色相比的性能。dapi 的兩種替代方案均為用戶提供了對活細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)的優(yōu)勢，而無需耗時的固定步驟。stainfree 技術(shù)使用戶不受染色程序的限制，并使他們能夠使用細(xì)胞進(jìn)行額外的下游分析。
優(yōu)勢
• 使用stainfree 技術(shù)實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞計數(shù)，同時無需染色前的固定步驟，避免昂貴
的染色程序
，節(jié)省時間和金錢
方法
cho-k1 細(xì)胞以20，000 至300 個細(xì)胞/孔的密度接種到96 孔板中，連續(xù)進(jìn)行兩倍稀釋，并在37°c 下附著并生長過夜。孵育后，在37°c 下用含4% 多聚甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水（pbs）固定孔的子集30 分鐘。固定后，用1x pbs 洗滌細(xì)胞兩次，然后在0.1% triton x-100 中孵育5 分鐘。用pbs 洗滌細(xì)胞兩次，并用pbs 中的2.9 µm dapi 染色30 分鐘。染色后，用pbs 洗滌細(xì)胞三次。
剩余的活細(xì)胞，并用活紅色染料染色。將染料儲備溶液在pbs 中以1：2000 的比例稀釋并添加到細(xì)胞中。孵育30 分鐘后，使用minimax 細(xì)胞儀上的透射光和紅色熒光（cy5）通道對活細(xì)胞進(jìn)行成像。使用softmax pro 軟件進(jìn)行stainfree 分析和核計數(shù)。圖1 顯示了使用stainfree 或live red dye 節(jié)省的時間。
為了進(jìn)行比較，在imagexpress® micro xls 寬場高內(nèi)涵分析系統(tǒng)中使用cy5 和dapi 通道對活（紅色染色）和固定（dapi 染色）細(xì)胞進(jìn)行成像。按順序?yàn)楸容^兩個成像系統(tǒng)的細(xì)胞計數(shù)，將目標(biāo)區(qū)域（roi）應(yīng)用于使用
minimax 細(xì)胞計數(shù)器采集的圖像，以匹配imagexpress micro xls 系統(tǒng)上成像的區(qū)域。使用softmax pro 軟件創(chuàng)建圖形。
圖1：使用stainfree 技術(shù)與活紅色染料與dapi。與使用dapi 進(jìn)行固定和染色相比，stainfree 工作流程可節(jié)省約70 分鐘的時間。此外，使用stainfree 技術(shù)分析的細(xì)胞仍然存活，并可用于其他檢測。
結(jié)果
用活紅色染料染色并在minimax 細(xì)胞計數(shù)器的紅色熒光和透射光通道上成像的細(xì)胞如圖2 所示。對于紅色熒光圖像，使用softmax pro 軟件中的預(yù)定義“nuclei”設(shè)置來準(zhǔn)確識別染色的細(xì)胞核。對于在透射光通道中成像的細(xì)胞，使用stainfree 技術(shù)來識別細(xì)胞。軟件中的預(yù)定義設(shè)置“cellsa”為這些cho 細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了精確的結(jié)果。stainfree 細(xì)胞計數(shù)與熒光細(xì)胞核計數(shù)非常接近（圖2，圖），表明minimax 細(xì)胞計數(shù)儀和softmax pro 軟件可準(zhǔn)確消除對細(xì)胞核染色計數(shù)的需求。使用imagexpress micro xlssystem 和metaxpress® 軟件對dapi 染色的細(xì)胞進(jìn)行成像和計數(shù)。對于比較，使用cy5 通道在同一系統(tǒng)上對活的紅色染料染色細(xì)胞進(jìn)行
成像。染色細(xì)胞的圖像如圖3 所示。使用兩種染料的細(xì)胞計數(shù)非常接近（圖3，圖）。通過此比較，我們確認(rèn)使用dapi 的細(xì)胞計數(shù)與使用stainfree 技術(shù)的細(xì)胞計數(shù)相當(dāng)。
圖2. 使用minimax 細(xì)胞計數(shù)器對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。用活紅色染料染色的細(xì)胞在紅色熒光（左上）或透射光（中上）通道中成像。stainfree 細(xì)胞計數(shù)（右上角，紫色掩膜）與基于紅色細(xì)胞核染色的細(xì)胞計數(shù)密切相關(guān)，如圖所示（綠色圓圈，stainfree 計數(shù)；紅色圓圈，紅色細(xì)胞核計數(shù)）。兩條曲線的r2值為0.99。
圖3. 在imagexpress xls 系統(tǒng)中計數(shù)的細(xì)胞。對用活紅色染料（左上）或dapi（右上）染色的細(xì)胞進(jìn)行成像，并通過在softmax pro 軟件（下圖）中繪制圖表來證明使用兩種染料獲得的計數(shù)的密切相關(guān)性。對于兩條曲線，r2均為0.99。
結(jié)論
stain free 技術(shù)和live red dye 在細(xì)胞計數(shù)方面與dapi 一樣有效，dapi 需要在染色前進(jìn)行固定。stainfree 細(xì)胞計數(shù)是最大限度地提高細(xì)胞活性和減少細(xì)胞處理時間的好選擇，因?yàn)樗炔恍枰獰晒馊玖希膊恍枰潭?。對于需要?xì)胞核染料的情況，例如，為了監(jiān)測細(xì)胞核大小或染色水平，可以使用活的紅色染料代替dapi，但不需要固定。它也不會干擾綠色熒光成像，因?yàn)閐api 已被證明是如此。使用stainfree 技術(shù)或live reddye 可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞檢測的更多多功能性。