表現出?的酶gus可以水解其基質衍生物pnpg,所產生的黃色生成物p-nitrophenol,可供活性測定 (jefferson et al, 1986);
儀器用具:elisa光?計 (dynatech);微?滴定盤 (microtiter plate, nunc f96 maxisorb 442404)
藥品試劑:基質溶液 (gus reaction buffer):pnpg (p-nitrophenyl β-d-glucuronide, sigma n-1627) 31.5 mg溶于buffer a-0 100 ml終止液 (stop buffer):2.5 m 2-amino-2-methyl propanediol (sigma a-9754)
方法步驟:
1) 吸取20 μl 的蛋白質樣本,小心注入微?滴定盤中,避免氣泡產生。
2) 每一樣品槽加入200 μl 基質液,混合均勻;可用燒熱的接種環(huán)去除氣泡。
3) 靜置約1~2 min,顏色開始加深,然后加入30 μl 終止液。 反應時間的長短,要以樣本中的酶活性大小?做調整。因為我們只測定色析法各分劃的相對酶活性,因此并?加終止液。
4) 以elisa 光?計測定波長415 nm 的吸光值。
酶活性單位的測定:
a. 以上步驟,只可測定gus 活性的相對大小,對色析法所得到的各個分劃進?偵測,相當方?,但并非酶活性單位的測定方法。
b. ?要測定酶的活性單位,要使用適當的酶用?,使酶在反應一段固定的時間后,其生成物的呈色吸光?,?在光?計的可測范圍的內;然后計算此段時間內,每分鐘所產生的吸光?增加?,轉換成生成物的莫耳數,即可求得其真正的活性單位。
c. 因此酶的活性單位定義為:每分鐘所能催化生成物的 μmole 數。