小麥源性成分探針法熒光定量pcr試劑盒實驗方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×pcr buffer
5 μl dntp mix (2mm)
4 μl 引物1(10pm)
2 μl 引物2(10pm)
2 μl taq酶 (2u/μl)
1 μl dna模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddh2o至 50 μl
視pcr儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置pcr儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,在72℃ 保溫7min。
3結束反應,pcr產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4pcr的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μl氯仿進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
pcr實驗步驟
典型的pcr由(1)高溫變性模板;(2)引物與模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反應組成一個循環(huán),通過多次循環(huán)反應,使目的dna得以迅速擴增。其主要步驟是:
將待擴增的模板dna置高溫下(通常為93℃-94℃)使其變性解成單鏈;
人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側的兩條單鏈互補結合,兩個引物在模板上結合的位置決定了擴增片段的長短;
耐熱的dna聚合酶(taq酶)在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入,以目的基因為模板從5’→3’方向延伸,合成dna的
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細胞名稱
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