護(hù)航全流程！宿主核酸殘留去除與檢測(cè)完整方案
· 背景介紹 ·近年來，生物制品已應(yīng)用到生物醫(yī)藥、生物農(nóng)業(yè)、生物能源、生物制造、生物環(huán)保等多種領(lǐng)域。隨著生物制品的市場(chǎng)占比越來越大，針對(duì)生物制品，國(guó)家和相關(guān)部門也建立起規(guī)范的質(zhì)量管理體系和標(biāo)準(zhǔn)，其中宿主細(xì)胞核酸殘留問題是備受關(guān)注的焦點(diǎn)之一。
生物制品如重組蛋白藥、抗體藥、疫苗、細(xì)胞與基因藥物等產(chǎn)品是用連續(xù)傳代的菌種株/細(xì)胞株表達(dá)的，因而產(chǎn)品內(nèi)可能會(huì)殘存宿主核酸。殘留的宿主細(xì)胞核酸可能引發(fā)細(xì)胞因增殖失控變?yōu)槟[瘤細(xì)胞，也有可能存在感染性病毒基因從而加劇體內(nèi)免疫反應(yīng)。為了規(guī)避上述不良后果，從生物制品安全角度和科研需求的層面，進(jìn)行有效的核酸殘留去除與嚴(yán)格的殘留檢測(cè)是非常重要的。
我國(guó)參照who、fda和歐盟的標(biāo)準(zhǔn)，在藥典中明確規(guī)定酵母、大腸桿菌表達(dá)的生物制品中的dna殘留量不超過10ng/劑，cho和vero細(xì)胞表達(dá)的epo、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超過100或10pg/劑。
01宿主核酸殘留的去除
1.1 主流去除方法的比較在核酸殘留去除工作中，由于dna帶有大量的電荷與其他生物大分子結(jié)合從而產(chǎn)生聚集（吸附）、包裹作用而難以除去。傳統(tǒng)的方法均存在核酸殘留去除不凈、工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)等缺陷，全能核酸酶則可解決此類難點(diǎn)。
1.2 翌圣方案全能核酸酶，又稱非限制性核酸內(nèi)切酶，是一種來源于serratia marcescen的非特異性核酸內(nèi)切酶。無論是實(shí)驗(yàn)研究，還是工業(yè)生產(chǎn)，全能核酸酶都是目前能夠同時(shí)有效去除dna和rna的酶。翌圣生物ucf.me®核酸酶在gmp條件下生產(chǎn)，可高效去除各種樣品中的核酸雜質(zhì)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。
翌圣生物ucf.me®核酸酶可降解無論是單鏈、雙鏈、線性、圓形還是超螺旋形式的dna及rna，無堿基偏好性。ucf.me®核酸酶具有的核酸酶活性以及的耐受性，可適用于多種操作環(huán)境，能夠在非常廣泛的條件下（6 m urea，0.1 m guanidine hcl，0.4% triton x-100，0.1% sds，1 mm edta，1 mm pmsf），短時(shí)間內(nèi)就使樣品中所有的游離核酸降解成長(zhǎng)度為2-5個(gè)堿基的長(zhǎng)度的5'-單磷酸寡核苷酸。后續(xù)也可以通過相應(yīng)的方法去除ucf.me®核酸酶，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.3 產(chǎn)品特性
※可以降解所有形式的dna和rna；
※核酸酶活性，樣品中的核酸殘留經(jīng)過短時(shí)間處理就能降低到皮克級(jí)別；
※穩(wěn)定性高，耐受性強(qiáng)，適應(yīng)各種操作條件；
※無動(dòng)物源性、無抗生素；
※gmp條件生產(chǎn)，滿足從研發(fā)到生產(chǎn)的大規(guī)模使用需求；
※審計(jì)資料齊全，產(chǎn)品申報(bào)無憂。
1.4 性能測(cè)試——不同反應(yīng)條件降解dna的效率檢測(cè)為了測(cè)試產(chǎn)品的使用性能，我們分別測(cè)試了2種溫度條件宿主dna殘留（gapdh/actin）和質(zhì)粒dna殘留情況（bla），結(jié)果顯示yeasen ultranuclease降解dna的效率與m公司相當(dāng)。（注：測(cè)試樣本為：hek293+慢病毒質(zhì)粒）
1.5 使用條件——有效條件與最佳使用條件針對(duì)ultranuclease，我們還進(jìn)行了使用條件的測(cè)試。測(cè)試結(jié)果如下表。隨著核酸酶使用濃度的升高，所需處理時(shí)間成倍性縮短。針對(duì)mg2+濃度、ph、溫度、dtt、巰基乙醇、單價(jià)陽離子、磷酸根離子等的最適濃度條件和有效條件我們均作了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臏y(cè)試。ultranuclease的耐受性強(qiáng)。
1.6 穩(wěn)定性測(cè)試1——不同因素對(duì)酶活的影響考慮到不同生產(chǎn)或研究過程中涉及眾多的因素有可能會(huì)影響ultranuclease的穩(wěn)定性，我們測(cè)定了9大常見因素對(duì)酶活的影響。在實(shí)際的研究中可以根據(jù)自身反應(yīng)工藝結(jié)合我們的測(cè)試數(shù)據(jù)做更加適合的體系優(yōu)化，更大限度的滿足各類特殊需求。
1.7 穩(wěn)定性測(cè)試2——儲(chǔ)存溫度&反復(fù)凍融&運(yùn)輸酶類產(chǎn)品通常需要非常嚴(yán)格的運(yùn)輸條件、儲(chǔ)存條件和凍融次數(shù)限制。我們測(cè)試了不同溫度條件下該酶的酶活變化情況、反復(fù)凍融次數(shù)對(duì)酶活的影響以及干冰運(yùn)輸對(duì)酶活的影響。結(jié)果顯示，-20℃條件下酶活8周均穩(wěn)定；4℃條件下4周內(nèi)酶活僅降低20%；37℃條件下酶活可穩(wěn)定2周。另外再-80至25℃之間凍融10次該酶也表現(xiàn)出較好的酶活特性；冰袋+干冰運(yùn)輸酶活不受影響。
1.8 質(zhì)量保證fda備案
生產(chǎn)流程嚴(yán)格參照iso9001/gmp的標(biāo)準(zhǔn)，符合gmp生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)
符合藥物ind申報(bào)要求
無動(dòng)物源性、無抗生素：使用植物源性和化學(xué)合成原料發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵過程中不添加抗生素
02宿主核酸殘留的檢測(cè)
全能核酸酶去除樣本核酸殘留后不免有引入全能核酸酶的影響，針對(duì)上述情況，yeasen也提供了相應(yīng)的檢測(cè)方案——ucf.me®ultranuclease elisa kit。該試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)（夾心elisa）原理檢測(cè)變性與非變性的ucf.me®ultra nuclease全能核酸酶的殘留，用抗ucf.me®ultra nuclease的兔多克隆抗體包被微孔板，形成固相抗體，向固相抗體微孔板中加入ucf.me®ultra nuclease標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，然后加入生物素（biotin）標(biāo)記的anti-ultra nuclease多抗，最后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（sa-hrp），形成抗體+ 抗原+抗體-biotin+sa-hrp復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加入tmb底物顯色；tmb在hrp酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)換成黃色，顏色的深淺與樣品中ucf.me®ultra nuclease的量呈正相關(guān)。本試劑盒檢測(cè)定量范圍0.047-3 ng/ml；檢測(cè)下限：23.5 pg/ml。