不同snp檢測(cè)技術(shù)的原理——arms、kasp、taqman、分子信標(biāo)及hrm
單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，snp）主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性，是人類可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。當(dāng)snp發(fā)生在基因編碼區(qū)或基因的調(diào)節(jié)區(qū)域時(shí)，它會(huì)對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生巨大的影響，從而影響基因的功能，例如鐮狀細(xì)胞貧血、β地中海貧血等單基因遺傳病的發(fā)生主要是由于snp的出現(xiàn)。同時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)，snp可能有助于預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)某些藥物的反應(yīng)，為臨床基因?qū)騻€(gè)體化治療提供理論依據(jù)。如cyp2c19參與氯吡格雷、s-美芬妥英、奧美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等藥物的代謝，fda和cfda分別于2010和2012年將cyp2c19基因檢測(cè)的重要性說(shuō)明納入氯吡格雷的藥物說(shuō)明書。snp所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換（transition嘧啶和嘧啶之間或者嘌呤和嘌呤之間的交換）或顛換（transversion嘧啶和嘌呤之間的交換）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。snp在cg序列上出現(xiàn)較為頻繁，由于cg中c即胞嘧啶常被甲基化，自發(fā)脫氨后即變?yōu)樾叵汆奏，因此大多數(shù)情況下，都是發(fā)生的c→t的轉(zhuǎn)換，而變成a和g的概率很小，所以一般認(rèn)為snp是二等位的，或者是二態(tài)性。圖1.基因組上的snp位點(diǎn)snp檢測(cè)方法眾多，大約有20多種，包括基于陣列的雜交、pcr和測(cè)序等，本文主要介紹基于pcr技術(shù)的部分基因分型方法。
01arms-pcr法arms pcr的全稱是突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)pcr（amplification refractory mutation system pcr），也稱為等位基因特異性pcr（allele-specific pcr, as-pcr），是基于taq dna聚合酶無(wú)法修復(fù)引物3’末端的單個(gè)堿基錯(cuò)配，從而使得擴(kuò)增受阻的檢測(cè)方法。
arms pcr將snp位點(diǎn)設(shè)計(jì)在上游引物3’末端，結(jié)合taqman探針的方法檢測(cè)熒光信號(hào)值，從而判斷野生型和突變型等位基因。換言之，我們應(yīng)用arms pcr對(duì)野生型和突變型等位基因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要設(shè)計(jì)兩條3’端核苷酸分別對(duì)野生型和突變型特異的上游引物，以及一條通用的下游引物，一條通用的探針。在taq dna聚合酶作用下，與模板不能匹配的上游引物將不能形成互補(bǔ)堿基對(duì)，從而產(chǎn)生錯(cuò)配，鏈延伸反應(yīng)因3’,5’-磷酸二酯鍵形成障礙而受阻，不能進(jìn)行延伸，而與模板匹配的引物體系則可以持續(xù)延伸，由于taq酶5’到3’外切酶活性，可將taqman探針上的熒光基團(tuán)水解，導(dǎo)致探針上熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的距離增大，從而使得熒光信號(hào)被儀器檢測(cè)到，最終計(jì)算出對(duì)應(yīng)的△ct值。
圖2.arms-pcr檢測(cè)原理
在arms-pcr基礎(chǔ)上也發(fā)展出了一些改良方法，如四引物擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)pcr（tetra-primer amplification refractory mutation system pcr，tetra-primer arms-pcr）。該方法需要設(shè)計(jì)四條引物，其中兩條為3’末端位于snp位點(diǎn)上的內(nèi)引物，這兩條引物方向相反，且分屬于不同基因型；另外兩條為通用外引物，且兩條引物與snp位點(diǎn)的距離應(yīng)不一樣。將四種不同的引物添加到預(yù)混液中，第一對(duì)引物旨在擴(kuò)增包含感興趣的snp（紅色）的dna序列，另外兩個(gè)引物對(duì)野生型（wt）等位基因（黃色）的正向鏈和突變型等位基因（橙色）的反向鏈具有序列特異性。
圖3.四引物擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)pcr檢測(cè)原理
通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果樣本是純合的，則會(huì)擴(kuò)增出兩個(gè)長(zhǎng)度的pcr產(chǎn)物：一個(gè)長(zhǎng)序列（紅色）和一個(gè)短序列（如果是野生型則為黃色，如果是突變型則為橙色）；如果樣本是雜合的，將擴(kuò)增出上述三種長(zhǎng)度的 pcr 產(chǎn)物。由于凝膠電泳檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，而且開(kāi)蓋進(jìn)行產(chǎn)物分析易造成污染，因此市面上使用arms-pcr方法開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品，大部分采用了閉管檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光pcr法。該方法理論上單個(gè)堿基的錯(cuò)配即可阻礙pcr的擴(kuò)增，但在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，單個(gè)堿基的錯(cuò)配依然可以延伸擴(kuò)增，只是效率較低。為了提高其特異性，有時(shí)需在3’端倒數(shù)第2位或第3位堿基處引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，該錯(cuò)配堿基與3’末端的錯(cuò)配堿基共同作用，以降低非靶標(biāo)序列的擴(kuò)增效率。此外，一個(gè)位點(diǎn)只需要一條taqman探針，探針序列固定，優(yōu)化上游引物即可，整體試劑開(kāi)發(fā)成本較低、周期較短；結(jié)果判讀方面來(lái)看，只需要看ct差值或者ct值有無(wú)即可，高效便捷。但該方法也存在一個(gè)樣本需要分兩管進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)、引物設(shè)計(jì)難度較大等問(wèn)題。
02kasp法kasp是指競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性pcr（kompetitive allele specific pcr），是一種基于pcr擴(kuò)增后熒光檢測(cè)的基因分型技術(shù)，最初由英國(guó)的kbioscience公司所開(kāi)發(fā)，目前kbiosciences公司已被英國(guó)政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室（lgc）收購(gòu)。該方法是基于引物末端堿基的特異性匹配對(duì)snp進(jìn)行檢測(cè)的方法，其技術(shù)原理如下：
第一步引物探針設(shè)計(jì)
首先，針對(duì)snp的等位基因設(shè)計(jì)兩條對(duì)應(yīng)的上游引物，引物3’末端分別位于各自的snp位點(diǎn)上，同時(shí)引物5’端各自帶有一段的標(biāo)簽序列，而下游引物則是一條常規(guī)設(shè)計(jì)共用的引物。引物一共是三條，兩條帶有標(biāo)簽序列的分型上游及一條通用下游。其次，設(shè)計(jì)兩條與上游引物標(biāo)簽序列一致的熒光探針，探針的5’端分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，同時(shí)對(duì)應(yīng)于熒光探針設(shè)計(jì)各自互補(bǔ)配對(duì)的淬滅探針，并在淬滅探針的3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針一共是四條，兩條熒光探針和兩條淬滅探針。
第二步普通pcr擴(kuò)增在第1輪pcr擴(kuò)增中，等位基因特異引物（3'末端能配對(duì)的）就可識(shí)別特定等位基因模板，完成等位基因識(shí)別，反向通用引物也會(huì)結(jié)合并完成整個(gè)pcr過(guò)程，在此階段，熒光探針仍與其互補(bǔ)的淬滅探針結(jié)合，不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。從第2輪pcr擴(kuò)增開(kāi)始，產(chǎn)物中出現(xiàn)含有通用標(biāo)簽序列（tag sequence）的模板，這步之后即可把通用標(biāo)簽序列引入與snp對(duì)應(yīng)的pcr產(chǎn)物中。隨后熒光探針與tag互補(bǔ)的dna鏈結(jié)合而添加到pcr產(chǎn)物中，因此不再與其互補(bǔ)的淬滅探針結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)而被檢測(cè)到。
第三步熒光檢測(cè)和分析利用熒光信號(hào)檢測(cè)儀或熒光定量pcr儀（配有相應(yīng)熒光探針的檢測(cè)通道）進(jìn)行信號(hào)讀取，并用軟件采集信號(hào)判別等位基因類型（如果進(jìn)行聚類分析，要用到klustercaller或snpviewer軟件）。
圖4.kasp法檢測(cè)原理
kasp法在整個(gè)過(guò)程中采用降落pcr的程序，從而保證探針和引物按照預(yù)期進(jìn)行結(jié)合，當(dāng)退火溫度高時(shí)，引物因?yàn)閠m值高，會(huì)先與模板進(jìn)行特異性的結(jié)合，然后在taq酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增，使得探針擴(kuò)增的原始模板得到富集，隨著退火溫度降低，探針開(kāi)始結(jié)合模板，然后產(chǎn)生熒光信號(hào)，最終在低于40度情況下通過(guò)讀取終點(diǎn)的熒光信號(hào)來(lái)進(jìn)行snp分型，保證了該方法很高的分型準(zhǔn)確性。另外，該方法針對(duì)上游引物標(biāo)簽序列合成通用探針，可以與各種不同的基因特異引物配合使用，而不需要針對(duì)每個(gè)特定的位點(diǎn)進(jìn)行探針合成，這極大降低了實(shí)驗(yàn)的試劑成本。其次，kasp在實(shí)驗(yàn)操作上滿足低、中、高通量基因分型的要求，相比于其他技術(shù)，具有一定的靈活性，更容易實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化檢測(cè)。該技術(shù)目前已在農(nóng)作物分子標(biāo)記輔助育種、種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和種子純度鑒定等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。
03taqman探針?lè)╰aqman探針是一種雙標(biāo)記、自淬滅的水解探針，在pcr反應(yīng)中加入兩條兩端帶有不同熒光標(biāo)記的特異探針來(lái)識(shí)別不同的等位基因。其5’和3’末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，在探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)兩者距離較近，熒光基團(tuán)的信號(hào)可被淬滅。而在pcr擴(kuò)增過(guò)程中，若taqman探針與靶標(biāo)序列匹配，探針則可結(jié)合在dna模板上，此時(shí)taq酶延伸至探針位置時(shí)，其外切酶活性將切割水解探針，釋放熒光基團(tuán)，使得熒光信號(hào)增強(qiáng)。而且，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增多，熒光信號(hào)越來(lái)越強(qiáng)，從而可通過(guò)儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化過(guò)程。
由于mgb探針的長(zhǎng)度可以設(shè)計(jì)得更短（短至13個(gè)堿基），有利于提高探針的識(shí)別特異性，因此用于檢測(cè)snp的taqman探針常用mgb修飾，在taqman探針的3’端結(jié)合小溝結(jié)合物（minor groove binder，mgb），mgb與dna螺旋的小溝（minor groove）契合，通過(guò)穩(wěn)定dna雙螺旋結(jié)構(gòu)來(lái)提高雜交的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。另外mgb探針包括一個(gè)不發(fā)光的淬滅基團(tuán)（nfq），能夠真正消除傳統(tǒng)淬滅基團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光信號(hào)，提高信噪比，提高檢測(cè)靈敏度。
圖5 taqman探針?lè)z測(cè)原理
taqman探針?lè)ㄏ鄬?duì)而言，方法成熟、操作便捷，體系/平臺(tái)相對(duì)開(kāi)放，臨床端認(rèn)可度高，在注冊(cè)文件審核等方面更有優(yōu)勢(shì)，是最常見(jiàn)的snp分型方法之一；但是其也有不可忽視的限制性，如每個(gè)位點(diǎn)需要兩條探針，探針價(jià)格昂貴，因此taqman探針?lè)ㄍǔＳ糜谏倭縮np位點(diǎn)大量樣本的分析，且對(duì)于近距離snp位點(diǎn)探針設(shè)計(jì)也是比較困難的。
04分子信標(biāo)法分子信標(biāo)是一段雙標(biāo)記的寡核苷酸探針，其5’末端和3’末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，且探針5’端和3’端的部分堿基可互補(bǔ)配對(duì)，從而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使得熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相互靠近而熒光信號(hào)較低。分子信標(biāo)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)部分包含snp檢測(cè)位點(diǎn)，當(dāng)模板與分子信標(biāo)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核酸序列匹配時(shí)，分子信標(biāo)可與模板雜交形成伸展?fàn)顟B(tài)，從而導(dǎo)致熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的空間距離拉大，熒光信號(hào)增強(qiáng)，因此可被儀器檢測(cè)，并確定snp位點(diǎn)。使用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)，則可區(qū)分snp類型。
圖6.分子信標(biāo)法檢測(cè)原理
分子信標(biāo)法與taqman探針?lè)愃?，均是通過(guò)探針中單個(gè)堿基的識(shí)別能力區(qū)分snp，只是分子信標(biāo)采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而taqman探針使用mgb修飾，以提高探針對(duì)snp的識(shí)別特異性。該方法本底低，特異性高，靈敏性高，不必與未反應(yīng)的探針?lè)蛛x即可檢測(cè)，可用于活體分析；但是探針合成時(shí)標(biāo)記較復(fù)雜，設(shè)計(jì)難度大。在進(jìn)行分子信標(biāo)的研究和應(yīng)用時(shí),莖干區(qū)和環(huán)狀區(qū)的序列設(shè)計(jì)是關(guān)鍵所在，這種設(shè)計(jì)不僅決定了其構(gòu)象，使在雜交后淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)之間的距離達(dá)到足夠大，而且決定了其合適的使用溫度。其次，環(huán)境ph值、純度也是影響分子信標(biāo)的重要因素，ph值過(guò)高，分子信標(biāo)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可能被破壞，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
05高分辨率熔解曲線（hrm）pcr擴(kuò)增的熔解曲線取決于其擴(kuò)增序列，序列中一個(gè)堿基的突變都可以導(dǎo)致雙鏈dna的解鏈溫度發(fā)生變化，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀監(jiān)測(cè)這種細(xì)微的溫度變化，可以知道擴(kuò)增的序列中是否有突變發(fā)生，從而對(duì)其進(jìn)行基因分型。
高分辨率熔解曲線（high-resolution melting analysis, hrm）是通過(guò)特定染料與擴(kuò)增特定的dna區(qū)域，在高分辨率熔解條件下對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溫度升降，通過(guò)熔解曲線的變化區(qū)分不同的基因型或等位基因。hrm檢測(cè)通常使用飽和熒光染料（如：lc green、lc green plus、syto 9等），具有更強(qiáng)的dna結(jié)合能力，且不影響pcr擴(kuò)增，在dna解鏈過(guò)程中也不會(huì)發(fā)生重排，使得熔解曲線具有更高的分辨率。
核酸片段的固有特性，如dna序列的長(zhǎng)度、gc含量和堿基互補(bǔ)性差異等，均能影響高分辨率熔解曲線，而結(jié)合高精度熒光定量pcr儀，其分辨精度則可達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分，從而可用于確定snp位點(diǎn)。
圖7.高分辨率熔解曲線法檢測(cè)snp結(jié)果示意圖
該方法引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，且單堿基改變、插入、缺失都能通過(guò)hrm來(lái)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，不需要探針，成本相對(duì)較低，并且可以發(fā)現(xiàn)未知突變（但不能知道具體的突變類型）。但是hrm技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的溫度分辨率要求相當(dāng)高，需要達(dá)到0.02~0.1℃，每升高1℃采集熒光25次，以滿足對(duì)單堿基差異的區(qū)分。對(duì)溫度均一性同樣要求較高，tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020-0.264℃（孔間溫度均一性要達(dá)到0.264℃以內(nèi)才能保證hrm分析結(jié)果的準(zhǔn)確性），一般pcr兩孔間溫差在0.3~0.5℃，這就導(dǎo)致兩孔間最終熔解溫度相差較大，無(wú)法保證hrm分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
snp分型原料分享翌圣生物作為上游原料企業(yè)，在分子酶領(lǐng)域深耕多年，目前已開(kāi)發(fā)了arms-pcr法及taqman探針?lè)ǖ膕np分型檢測(cè)通用原料，已被下游廠家應(yīng)用于腫瘤伴隨診斷、藥物基因組學(xué)、單基因遺傳病、疾病易感性研究等多個(gè)領(lǐng)域。
產(chǎn)品名稱 貨號(hào) 備注
2×hieff unicon® taqman snp genotyping master mix 13152es taqman探針?lè)?
2×hieff® blood direct taqman qpcr master mix(low rox) 13095es
2×hieff unicon® multiplex arms qpcr mix 13755es arms-pcr法
2×hieff unicon® multiplex arms qpcr kit 13229es
hieff unicon® hotstart super specific taq dna polymerase 14318es 單酶
10×taq pcr buffer(with mgcl2) 11373es 通用buffer
通過(guò)上面snp科普般的分享，相信大家對(duì)部分主流snp檢測(cè)方法及特點(diǎn)有了基本的了解，那snp主要在哪些應(yīng)用領(lǐng)域起作用，以及常見(jiàn)的snp問(wèn)題有哪些，限于篇幅原因，敬請(qǐng)期待下篇snp干貨分享哦！