實(shí)驗(yàn)原理
堿性磷酸酶（alkaline phosphatase ec 3.1.3.1簡稱為alpase）廣泛存于微生物界和動(dòng)物界。alpase能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，磷酸基團(tuán)從磷酸酯轉(zhuǎn)移到醇、酚或糖等磷酸受體上。在磷的生物和化學(xué)循環(huán)過程中，alpase起了及其重要的作用。在生物體內(nèi)alpase與磷的代謝直接相關(guān)，參與磷與鈣物質(zhì)的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化過程。alpase的作用適ph在堿性區(qū)域，一般在ph9.0~10.5范圍內(nèi)。mg2+對該酶的活力有顯著的激活使用。
為了獲得好的提取效果，在酶的制備過程，特別應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
選取來源豐富、酶含量高的新鮮材料。提取工作應(yīng)在獲得材料后立刻開始，否則應(yīng)在低溫下保存。用鹽分級沉淀是一種應(yīng)用非常廣泛的方法。碳酸銨是常用的鹽。操作時(shí)，要注意保持緩沖液的合適ph值和溫度。在加碳酸銨時(shí)需事先將其研細(xì)，需緩慢加入并及時(shí)攪拌溶解，盡量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面變性。鹽析生成的沉淀，要靜置20min以上，以使沉淀*，然后方可時(shí)行離心分離。有機(jī)溶劑沉淀法也常用于蛋白質(zhì)的分離提純。丙酮和乙醇是使用廣泛的兩種有機(jī)溶劑。應(yīng)注意在低溫下操作，緩慢加入，充分?jǐn)嚢?，避免局部濃度過高放出大量熱量而使酶蛋白變性。離心收集沉淀后，立即將其溶于適量緩沖液中，以避免酶活力的喪失。在酶的制備過程中，每經(jīng)一步處理，都需測定酶的活力和比活力。唯有比活力提高較大，提純步聚才有效。酶活力的分析：通常是以對—硝基苯磷酸二納（pnpp)為底物，在ph10.1的碳酸鹽緩沖液（含2mmol/l mg2+）的測活體系中檢測酶催化pnpp水解產(chǎn)生黃色的對硝基苯（ pnp）在405 nm處有大的吸收峰，可以根據(jù)od4〇5值的增加計(jì)算酶活力的大小。酶活力定義為在37℃下，以5mmol/l pnpp為底物，在ph 10.1的碳酸鹽緩沖液含2 mmol/l mg2+的測活體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 mol/l pnp的酶量定為1個(gè)酶活力單位。酶的比活力定義為每mg蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。
蛋白質(zhì)濃度的測定常采用福林-酚試劑(folin-phenolreagem)顯色法，詳見北京來亨科貿(mào)有限責(zé)任公司技術(shù)文章。