蛋白質(zhì)印跡是研究實驗室普遍使用的一種技術(shù)，用于研究感興趣的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡用于抗體驗證、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究以及許多其他應用。1然而，生成可解釋的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果可能具有挑戰(zhàn)性。以下是一些常見問題以及解決方法。
高背景可能是由于嘗試這個
高抗體濃度 使用一抗和二抗進行滴定。包括已知的蛋白質(zhì)對照。
封閉液 使用新鮮的封閉液，增加封閉時間/溫度，嘗試不同的封閉劑。
印跡在封閉/洗滌過程中干燥 確保膜在封閉和清洗步驟中被充分覆蓋。
洗得不夠 增加洗滌次數(shù)和洗滌液體積。確保至少洗滌 3 次，每次 5 分鐘。
膠片曝光過度 嘗試較短的曝光時間。
沒信號可能是由于嘗試這個
抗體濃度太低 使用一抗和二抗進行滴定。包括已知的蛋白質(zhì)對照。
樣品中目標含量低 增加凝膠上的蛋白質(zhì)濃度。建議滴定。
一抗和二抗不匹配 確保二抗針對一抗的宿主物種。
轉(zhuǎn)移問題 使用帶有顏色的蛋白質(zhì)標記來檢查轉(zhuǎn)移。使用對照蛋白優(yōu)化轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移前檢查是否有氣泡。
洗次數(shù)太多 減少洗滌次數(shù)。
多頻段可能是由于嘗試這個
凝膠超載 滴定加載在凝膠上的蛋白質(zhì)樣品。
使用過多抗體 使用一抗和二抗進行滴定。包括已知的蛋白質(zhì)對照。
膠片曝光過度 嘗試較短的曝光時間。
阻塞問題 使用新鮮的封閉液，增加封閉時間/溫度，嘗試不同的封閉劑。
目標蛋白的翻譯后修飾 研究發(fā)表了目標蛋白翻譯后修飾的例子，可以提供生物學解釋（即磷酸化、糖基化、核糖基化）。
翻譯后裂解 許多蛋白質(zhì)被合成為前蛋白質(zhì)，然后被切割成活性形式，例如前半胱天冬酶。研究針對您的目標發(fā)布的示例。
拼接變體 選擇性剪接可能會產(chǎn)生由同一基因產(chǎn)生的不同大小的蛋白質(zhì)。研究針對您的目標發(fā)布的示例。