crispr-cas9 為基因工程領(lǐng)域打開了一扇嶄新的大門。這個相對簡單的分子生物學工具幾乎可以用來編輯任何基因組。crispr-cas9 復合物由可編碼的 guide rna (grna) 和 cas9 核酸酶組成，這兩種成分結(jié)合形成核糖核蛋白復合物（rnp），然后結(jié)合并切割目標基因，再進一步利用細胞的修復機制來實現(xiàn)基因組的編輯。
在過去的幾年里，crispr-cas9 技術(shù)已經(jīng)被越來越多的研究人員所采用，并且在包括醫(yī)學、農(nóng)業(yè)和疾病控制等許多領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響。
在設(shè)計 crispr 實驗時，grna 和 cas9 的結(jié)構(gòu)是一個需要考慮的重要因素。在瞬時轉(zhuǎn)染的時候 (即成分短暫存在于細胞內(nèi))，grna 和 cas9 可以用質(zhì)粒 dna、rna 或預先復合的 rnps 傳遞。目前有許多研究人員傾向于選擇質(zhì)粒，因為它們便宜、易于使用，而且可以加入標記基因。然而，用質(zhì)粒表達 grna 和 cas9 也存在一些問題。
在這篇文章中，我們將概述其中的一些缺陷，并指出為什么使用 rnps 是更好的選擇的。
crispr 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染會增加脫靶效應
在任何 crispr 實驗中，令人關(guān)注的方面之一就是在錯誤的位置切割基因組 dna，即脫靶效應。雖然精心設(shè)計的 grna 會在大多數(shù)情況下結(jié)合在正確的 dna 位點，但是它們也可能會與只有少數(shù)錯配的序列結(jié)合。這些脫靶效應會造成嚴重問題，因為被錯誤編輯的基因位點可能會改變表型，或是對目標細胞與有機體產(chǎn)生有害影響。
crispr 組成以質(zhì)粒形式導入常常與高水平的脫靶效應相關(guān)。這種效應是由于質(zhì)粒在細胞內(nèi)停留的時間相對較長，可能會持續(xù)數(shù)周。期間 grna 和 cas9 會大量表達，因此有更大可能性使得 grna-cas9 切割錯誤的位點。
幾項研究表明，當 crispr 組成成分以預先復合的 rnps 而非質(zhì)粒 dna 的形式傳遞時 (liang et al. 2015,kim et al. 2014) ，脫靶突變的頻率較低。例如，liang 等人 (2015) 發(fā)現(xiàn)，對于 ot3-18 基因，與質(zhì)粒 dna 相比，當使用 rnps 時，脫靶突變與目標突變的比率降低了 28 倍。rnps 較低的脫靶率可能與其在細胞內(nèi)活性維持時間較短相關(guān)。與質(zhì)粒不同的是，rnps 在轉(zhuǎn)染后能迅速切割基因組 dna，并且在細胞中只停留一天左右就被降解了 (kim 等人 2014)。由于切割基因組 dna 的時間更短，所以脫靶效應也減少了。
質(zhì)粒 dna 可能會整合到宿主基因組上
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的另一個潛在問題是質(zhì)粒 dna 的全部或部分序列可能會隨機整合到目標細胞的基因組中。kim 等人 (2014) 發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒導致的插入普遍存在于目標和非目標位點。雖然可以通過測序檢測目標位點是否存在插入片段，但確定非目標位點的插入就變得困難許多，因此應當使用 rnps 轉(zhuǎn)染來避免外源 dna 整合進基因組。
rnps 對細胞的毒性比 crispr 質(zhì)粒小
dna 轉(zhuǎn)染通常會給細胞帶來生存壓力，外源 dna 的存在可能觸發(fā)人原代細胞和多能干細胞中環(huán)化 gmp-amp 合成酶的激活。對于這種敏感的細胞類型，使用 rnp 而不是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以降低對細胞的毒性。根據(jù) kim 等人 (2014) 的研究，與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，rnps 轉(zhuǎn)染至少可以產(chǎn)生 2 倍以上的有活性的胚胎干細胞集落。
質(zhì)粒表現(xiàn)出多變的 crispr 編輯效率
質(zhì)?？赡艽嬖谫|(zhì)量問題。當 crispr 組分以質(zhì)粒 dna 的形式轉(zhuǎn)染時，在進行任何基因編輯之前，需要在細胞內(nèi)進行 grna 和 cas9 轉(zhuǎn)錄與 cas9 翻譯。這不僅延長了實驗時間，而且 grna 的表達或者 cas9 的組裝和折疊有出錯的風險。使用 rnps 則可以避免這些問題，因為 grna 和蛋白質(zhì)成分是在轉(zhuǎn)染之前制備的，而且 grna 和 cas9 的質(zhì)量可以在它們被導入細胞之前得到驗證。
rnp 的另一個好處是使得 grna 受到 cas9 的保護，從而降低 grna 降解的風險。此外，合成的 grna 可以進行化學修飾，以防止核酸內(nèi)切酶降解和免疫攻擊。這兩種因素都能使 grna 在短時間內(nèi)更有效地靶向基因組 dna (hendel & bak 等人 2015)。
考慮到 rnps 的諸多優(yōu)勢，它們在多種永生細胞、原代細胞和干細胞中都能一直保持高編輯效率也就不足為奇了，(e.g., hendel & bak 等 2015, kim 等 2014, liang 等 2015,lin 等 2014). 此外，我們都知道通過同源定向修復機制實現(xiàn)基因敲入是一個效率極低的過程，但通過使用 rnps 我們可以提升這一過程的效率。(gaj 等 2017, lin 等 2014,schumann 等 2015).
用 rnps 代替質(zhì)粒來做 crispr 值得嗎？
當嘗試用 rnps 替換質(zhì)粒時，你可能仍然在想質(zhì)粒的一些優(yōu)點，比如，它們很便宜。但問問你自己，這些所謂的優(yōu)點真的值得你在你的細胞中引入更多的脫靶編輯嗎? 或者甚至是將外源 dna 整合進你的細胞賴以生存的必需基因中? 有些人或許會認為，質(zhì)粒中可以加入標記基因 (如抗生素基因) 是一種*的優(yōu)勢，因為它能使你富集被轉(zhuǎn)染的細胞。然而，由于使用 rnps 通常會讓你的編輯效率超過 70%，所以向質(zhì)粒中加入標記基因變得*不必要了?？紤]到這些因素，你應該明白 rnps 的好處已經(jīng)遠遠超過其成本了。從今天起，讓 rnps 成為你得心應手的 crispr 工具吧！