和pcr比起來，qpcr不用跑膠，實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增狀況，操作更為便捷。下面以德國mbvenor®gem支原體檢測試劑盒（qpcr一步法）（venor®gem qonestep）為例，略述檢測原理和過程。
該試劑盒包括4管試劑，其中2管分別為緩沖液和pcr水，另2管為主要試劑。1管即mix，含引物、核苷酸、聚合酶、熒光素標(biāo)記的探針和內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照。另1管為陽性對(duì)照，均為凍干粉。
它通過擴(kuò)增高度保守的rrna操縱子，或者更準(zhǔn)確地說，擴(kuò)增支原體基因組中的16s rrna編碼區(qū)，可以特異性地檢測支原體。在520nm（famtm通道）檢測支原體特異性擴(kuò)增片段。在610nm（hextm通道）檢測內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照的擴(kuò)增。它能特異性檢測所有導(dǎo)致細(xì)胞污染的柔膜體物種。真核dna不會(huì)被擴(kuò)增。通過內(nèi)部對(duì)照，可檢測pcr抑制劑的存在或不正確的dna提取引起的假陰性結(jié)果。樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清液。檢測程序可在3小時(shí)內(nèi)完成。在檢測前，樣本需要一定的制備。具體是將100μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移至無菌的1.5 ml反應(yīng)管中。關(guān)上蓋子扣緊。將樣品在95°c下孵育5分鐘。以大速度短暫離心樣品（15秒）以沉淀任何細(xì)胞碎片。然后可直接取2μl上清液進(jìn)行qpcr。
qpcr反應(yīng)體系一共是25ul，其中樣本2ul，其余是master mix。注意設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照（無模板對(duì)照）。
如果檢測的ct<40，則表明pcr結(jié)果陽性。如果檢測的ct≥40，則pcr反應(yīng)結(jié)果為陰性。如果fam陽性，則支原體陽性。如果fam陰性，hex也陰性，表明pcr擴(kuò)增出了問題，需要重做。如果fam陰性，hex陽性，表明支原體確實(shí)陰性。
pcr擴(kuò)增出了問題主要原因?yàn)閜cr反應(yīng)被抑制了，可能需要考慮做dna抽提。
在qpcr反應(yīng)中，引物和探針的設(shè)計(jì)尤為重要，它既需要覆蓋大多數(shù)支原體，又需要不與細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞dna發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)然，taq酶的性能也很重要，因?yàn)閐na的擴(kuò)增終依賴于酶的活性和擴(kuò)增的速度。從這個(gè)角度說，一個(gè)好的qpcr試劑盒是各個(gè)因素共同作用的結(jié)果。