中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
sn/t 5511-2023
出口調(diào)味料、調(diào)味面制品及肉制品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法
determination of papaverine，noscapine，thebaine，morphine and codeine in flavoring，seasoned flour products and meat products for export-lc-ms/ms method
前言
本文件按照gb/t 1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》、
gb/t 20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標(biāo)準(zhǔn)》和sn/t 0001-2016《出口食品、化妝品理化測定方法標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定》的規(guī)定起草。
請注意文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。
本文件由中華人民共和國海關(guān)總署提出并歸口。
本文件起草單位：銀川海關(guān)技術(shù)中心、西安海關(guān)技術(shù)中心、合肥海關(guān)技術(shù)中心、寧夏回族自治區(qū)食品檢測研究院、寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、杭州海關(guān)技術(shù)中心。
本文件主要起草人：王芳煥、李子豪、宋偉、陳林、馬桂娟、賀生芳、楊春霞、李婧、郝俊虎、孫敏、李竹巖、謝文。
1范圍
本文件規(guī)定了出口調(diào)味料、調(diào)味面制品及肉制品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法。
本文件適用于固體調(diào)味料、調(diào)味面制品、肉制品、火鍋調(diào)味料、調(diào)味油及含有固體調(diào)味粉的湯料等等食品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因的定性鑒別及定量測定。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。
3術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4方法原理（提要）
采用鹽酸溶液提取樣品中的罌粟堿五項，用正己烷脫油脂，固相萃取柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定，罌粟堿、那可丁和蒂巴因采用外標(biāo)法定量，嗎啡和可待因采用內(nèi)標(biāo)法定量。
5試劑和材料
除非另有說明，所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級水。
5.1甲醇：色譜純。
5.2乙腈：色譜純。
5.3氨水。
5.4濃鹽酸。
5.5乙酸銨。
5.6正己烷：色譜純。
5.7鹽酸溶液（0.1 mol/l）：量取鹽酸8.33 ml（5.4），加水至1 l，搖勻備用。
5.8氨化甲醇溶液（5+95，v/v）：量取氨水（5.3）5 ml，加甲醇（5.1）至100 ml，搖勻備用。
5.9乙酸銨溶液（5 mmol/l）：準(zhǔn)確稱取0.77 g乙酸銨（5.5）溶解于適量水中，定容至2 l，混勻備用。
5.10乙腈-5 mmol/l乙酸銨溶液（95+5，v/v）：量取95 ml乙腈和5 ml 5 mmol/l乙酸銨溶液（5.10），混勻。
5.11甲醇-水溶液（1+1，v/v）：量取50 ml甲醇和50 ml水，混勻。
5.12罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（papaverine）：c20h21no4，cas no.58-74-2；嗎啡標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（noscapine）：
c22h23no7，casno.128-62-1；蒂巴因（thebaine）：c19h21no3，casno.115-37-7；嗎啡標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（morphine）：c22h23no7，cas no.57-27-2；可待因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（codeine）：c18h21no3，cas no.76-57-3；嗎啡-d3（morphine-d3）：c17h16d3no3，cas no.67293-88-3；可待因- d3（codeine-d3）：c18h18d3no3，casno.105843-36-5。純度均大于等于98%。
5.13標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 mg/ml）：精密稱取鹽酸罌粟堿、那可丁、嗎啡、可待因和蒂巴因標(biāo)準(zhǔn)品適量（5.12），用甲醇（5.1）配制成罌粟堿、那可丁、可待因、嗎啡和可待因的濃度均為1.0 mg/ml的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。4℃避光保存，有效期六個月。
5.14混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密吸取濃度為1.0 mg/ml的罌粟堿、那可丁、蒂巴因儲備液各1.0 ml和濃度為1.0 mg/ml的嗎啡、可待因儲備液各5 ml于20 ml容量瓶中，用甲醇（5.1）定容至刻度，搖勻，即得含有罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為50μg/ml和嗎啡、可待因濃度為250μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。4℃避光保存，有效期三個月。
5.15同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液（5.0μg/ml）：分別精密稱取內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（5.12）適量，用甲醇（5.1）配制成濃度為5.0μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。4℃避光保存，有效期三個月。
5.16標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別精密吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（5.14）和同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液（5.15）適量，用乙腈-5 mmol/l乙酸銨溶液（5.10）稀釋成罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml，嗎啡、可待因濃度分別為5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，內(nèi)標(biāo)溶液濃度均為20.0 ng/ml。臨用新配。
5.17固相萃取柱：n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物基質(zhì)-so3h，60 mg，3 ml或相當(dāng)者。使用前用5 ml甲醇（5.1），5 ml 0.1 mol/l鹽酸（5.7）活化。
5.18微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)相針式過濾器。
6儀器和設(shè)備
6.1液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（esi）。
6.2分析天平：感量為0.01 g和0.000 1 g。
6.3離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不小于4 000 r/min。
6.4固相萃取裝置。
6.5氮吹儀。
7分析步驟
7.1樣品制備與保存
7.1.1固體調(diào)味料、調(diào)味面制品、肉制品、火鍋調(diào)味料
取出有代表性樣品約500 g，用粉碎機(jī)全部粉碎后充分混勻，均勻分成二份作為試樣，分裝入潔凈的容器內(nèi)，密封并做好標(biāo)記，于-18℃以下溫度保存。
7.1.2調(diào)味油、含有固體調(diào)味粉的湯料
取代表性樣品約500 g，裝入潔凈的容器中，密封并標(biāo)識，于-18℃以下溫度保存。
7.2提取
稱取約2 g試樣（精確至0.01 g），置于50 ml離心管中，加入8μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液（5.15），加入10 ml 0.1 mol/l鹽酸溶液（5.7）超聲10 min，4 000 r/min離心5 min后，加入2 ml正己烷（5.6），靜置，待凈化。
7.3凈化
分別用5 ml甲醇（5.1），5 ml 0.1 mol/l鹽酸（5.7）活化固相萃取柱（5.17），移取5 ml提取液（7.2）通過固相萃取柱，再加5 ml 0.1 mol/l鹽酸（5.7），5 ml甲醇-水溶液（5.11）淋洗固相萃取柱，吹干，最后用5 ml氨化甲醇（5.8）洗脫，收集全部流出液，35℃氮氣吹干。用1 ml乙腈-5 mmol/l乙酸銨溶液（5.10）溶解殘渣，渦旋2 min，過0.22μm有機(jī)相微孔濾膜后（5.18），供lc-ms/ms測定。
7.4測定
7.4.1液相色譜條件
液相色譜條件如下：
a）液相色譜柱：hilic色譜柱，100 mm×2.1 mm（內(nèi)徑），1.7μm，或性能相當(dāng)者。
b）流動相：a為乙腈，b為5 mmol/l乙酸銨溶液。
c）柱溫：35±1℃。
d）進(jìn)樣量：5.0μl。
e）流速：0.3 ml/min。
f）流動相及梯度洗脫條件：見表1。
表1液相色譜梯度洗脫程序
時間/min
乙腈/%
5 mmol/l乙酸銨溶液/%
0.00
95
5
2.00
95
5
4.00
85
15
6.50
70
30
7.00
95
5
9.00
95
5
7.4.2質(zhì)譜參考條件
質(zhì)譜條件如下：
a）離子源：電噴霧離子源（esi）；
b）掃描方式：正離子掃描；
c）檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（mrm）；
d）霧化氣、干燥氣、輔助氣為高純氮氣、碰撞氣為高純氬氣；使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各參數(shù)使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求。參考條件見附錄a。
7.4.3定性測定
按照液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，如果檢測的的質(zhì)量色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間相差不超過±2.5%，定性離子對的相對豐度（是用相對于最強離子豐度的強度百分比表示）與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對豐度一致，相對豐度允許偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的被測物。
7.4.4定量測定
在儀器最佳狀態(tài)下，將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.16）按濃度由低到高進(jìn)樣檢測，以定量子離子峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣液中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋至相應(yīng)范圍內(nèi)再進(jìn)樣分析。罌粟堿、那可丁、蒂巴因采用外標(biāo)法定量，嗎啡、可待因采用內(nèi)標(biāo)法定量。在上述色譜條件下，罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因嗎啡-d3和可待因-d3的多反應(yīng)監(jiān)測（mrm）色譜圖參見附錄b，出峰時間分別為4.02 min、3.08 min、4.96 min、5.41 min、5.34 min、5.41 min和5.34 min。
7.4.5空白試驗
除不加試樣外，按上述測定步驟進(jìn)行。
7.4.6結(jié)果計算與表述
試樣中待測物的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（1）計算獲得，計算結(jié)果需扣除空白值。
式中：
x——試樣中被測物殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）；
c——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的被測組分溶液濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v——樣液最終定容體積，單位為毫升（ml）；
m——樣液相當(dāng)?shù)脑嚇淤|(zhì)量，單位為克（g）。
8定量限與回收率
8.1定量限（loq）
本方法罌粟堿、那可丁、蒂巴因和嗎啡、可待因的定量限分別為2μg/kg、2μg/kg、2μg/kg、10μg/kg、10μg/kg。
8.2回收率
在三個添加濃度范圍內(nèi)，固體調(diào)味料、調(diào)味面制品、肉制品、火鍋調(diào)味料、調(diào)味油及含有固體調(diào)味粉的湯料中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因不同添加水平的平均回收率數(shù)據(jù)參見附錄c。