中華人民共和國國家標準
gb 31656.3-2021
食品安全國家標準
水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹殘留量的測定高效液相色譜法
national food safety standard-determination of norfloxacin，ciprofloxacin，enrofloxacin，ofloxacin，oxolinic acid and
flumequine residues in fishery products by high performance liquid chromatography
1范圍
本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹殘留量檢測的制樣和高效液相色譜測定方法。
本文件適用于水產(chǎn)品中魚類肌肉組織蝦、蟹、貝類的可食組織中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹殘留量的檢測。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可（ke）少的條款。其中注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
gb/t 30891-2014水產(chǎn)品抽樣規(guī)范
3術語和定義
本文件沒有需要界定的術語和定義
4原理
試料中殘留的諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹，經(jīng)酸化乙腈提取，正己烷脫脂，c18固相萃取柱凈化，液相色譜熒光檢測法測定，外標法定量。
5試劑與材料
除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合gb/t 6682規(guī)定的一級水。
5.1試劑
5.1.1乙腈（ch3cn）：色譜純。
5.1.2甲醇（ch3oh）：色譜純，
5.1.3正己烷（c6h14）：色譜純
5.1.4鹽酸（hcl）。
5.1.5磷酸（h3po4）。
5.1.6氨水（nh3·h2o）。
5.1.7氫氧化鈉（naoh）。
5.1.8二水合磷酸二氫鈉（nah2po•2h2o）。
5.1.9無水硫酸鈉（na2so4）。
5.1.10四丁基溴化銨（c16h36brn）。
5.2標準品
氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹：含量≥98.0%，詳見附錄a。
5.3溶液配制
5.3.1鹽酸溶液：取鹽酸50 ml，加水稀釋至100 ml，混勻。
5.3.2磷酸溶液：取磷酸1 ml，加水稀釋至10 ml，混勻。
5.3.3酸化乙腈溶液：取乙腈250 ml，加鹽酸溶液2 ml，充分混勻。
5.3.4乙腈飽和正己烷溶液：取正己烷200ml于250ml分液漏斗中，加適量乙腈后，劇烈振搖，待分配平衡后，棄去乙腈層，即得。
5.3.5 0. 1 mol/l鹽酸溶液：取鹽酸9 ml，用水稀釋至1 000 ml。
5.3.6 0.1 mol/l氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉4 g，用水溶解并稀釋至1 000 ml。
5.3.7 0.05mol/l磷酸鹽緩沖溶液：取二水合磷酸二氫鈉1.56g，加0.1mol/l氫氧化鈉溶液79ml溶解，用水稀釋至200 ml。
5.3.8 0.01mol/l四丁基溴化銨溶液（ph3.0）：取四丁基溴化銨3.22g，加水900ml使溶解，用磷酸溶液調(diào)節(jié)ph到3.0，用水稀釋至1 000 ml。
5.3.9洗脫液：取氨水25 ml，用甲醇稀釋至100 ml。
5.4標準溶液制備
5.4.1諾氟沙星、氧氟沙星標準儲備液（100μg/ml）：取諾氟沙星、氧氟沙星各約10mg，精密稱定，用0.1 mol/l鹽酸溶液10 ml使溶解，用乙腈稀釋定容至100 ml棕色容量瓶中，搖勻，即得。4℃以下避光保存，有效期3個月。
5.4.2環(huán)丙沙星、恩諾沙星標準儲備液（100μg/ml）：取鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星各約10 mg，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋定容至100 ml棕色容量瓶中，播勻，即得。4℃以下避光保存，有效期3個月。
5.4.3噁喹酸、氟甲喹標準儲備液（100μg/ ml）：取噁喹酸、氟甲喹各約10 mg，精密稱定，用0.1 mol/l氫氧化鈉溶液10 ml使溶解，加乙腈稀釋定容至100 ml棕色容量瓶中，播勻，即得。4℃以下避光保存，有效期3個月。
5.4.4混合標準工作液（10μg/ml）：精密量取諾氟沙星、氧氟沙星標準儲備液，環(huán)丙沙星、恩諾沙星標準儲備液，噁喹酸、氟甲喹標準儲備液各1 ml，于10 ml棕色容量瓶中，用流動相a稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為10μg/ml混合標準工作液。4℃以下避光保存，有效期1個月。
5.5材料
c18固相萃取柱：500mg/3ml，或相當者。
6儀器和設備
6.1高效液相色譜儀：配熒光檢測器。
6.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3氮吹儀。
6.4超聲波振蕩器。
6.5均質(zhì)機：15 000 r/min。
6.6離心機：4 000 r/ min。
6.7尼龍微孔濾膜：0.22μm。
6.8梨形瓶：100 ml。
6.9分液漏斗：250 ml。
6. 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。
6.11分液漏斗振搖器。
7試樣的制備與保存
7.1試樣的制備
取適量新鮮或解凍的空白或供試組織，按gb/t 30891-2014中附錄b的要求制樣。
a）取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試樣；
b）取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試樣；
c）取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液，作為空白添加試樣。
7.2試樣的保存
-18℃以下保存，3個月內(nèi)進行分析檢測。
8測定步驟
8.1提取
稱取試樣5 g（準確至±0.02 g），加酸化乙腈溶液20 ml、無水硫酸鈉10 g，高速均質(zhì)1 min~2 min，3000r/min離心5min，取上清液至分液漏斗，用酸化乙腈溶液20ml，清洗刀頭并溶解沉淀，重復提取2次，合并上清液。加乙睛飽和正己烷溶液60 ml，置分液漏斗振搖器（150 r/min）上振蕩20 min，靜置，取下層乙腈至梨形瓶，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。加磷酸鹽緩沖液4 ml，超聲振蕩1 min，靜置30 s，溶液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管。再重復提取殘余物2次，溶液轉(zhuǎn)移至同一離心管，合并3次殘余物溶解液，3 0000 r/min離心5 min，取上清液，備用。
8.2凈化
取c18固相萃取柱，依次用甲醇、水磷酸鹽緩沖液各3ml活化。取上述備用液過柱，流速控制為每秒1滴。水3ml淋洗，抽干，加洗脫液5ml，收集洗脫液，50℃氮氣吹干，加流動相a1.0ml使溶解，過0.22μm微孔濾膜，高效液相色譜測定。
8.3標準曲線的制備
分別精密量取混合標準工作液適量，用流動相a稀釋成濃度分別為10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、500 ng/ml、1 000 ng/ ml、2000 ng/ml的系列標準溶液，供高效液相色譜分析；現(xiàn)用現(xiàn)配。以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標，制作標準曲線。
8.4測定
8.4.1色譜條件
a）色譜柱：c18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm），或相當者；
b）流動相：a為0.01 mol/l四丁基溴化銨溶液乙腈（94：6，v/v），b為乙腈，梯度洗脫條件見表1；
c）流速：0.9 mll/min；
d）柱溫：35℃；
e）進樣量：10μl；
f）檢測波長：時間程序見表2。
8.4.2測定法
取試樣溶液和標準溶液，作單點或多點校準，按外標法以色譜峰面積定量。標準溶液及試樣溶液中目標藥物的峰面積均應在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。在上述色譜條件下，混合標準溶液色譜圖見附錄b。
8.5空白試驗
取空白試料，除不加標準溶液外，采用相同的測定步驟進行平行操作。
9結果計算和表述
試樣中待測藥物的殘留量按標準曲線或公式（1）計算。
式中：
x——試樣中被測組分殘留量的數(shù)值
cs——標準工作液測得的相應被測組分溶液濃度的數(shù)值，單位為納克每毫升（ng/ml）；
a——試樣溶液中相應被測組分峰面積
as——標準溶液中相應被測組分峰面積，
v——試樣溶液定容體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為的（g）。
10方法靈敏度、準確度和精密度
10.1靈敏度
本方法諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星的檢測限為2.5μg/kg，噁喹酸、氟甲喹的檢測限為5μg/kg；諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星的定量限為5μg/kg，噁喹酸、氟甲喹的定量限為10μg/kg。
10.2準確度
諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星在水5μg/kg~100μg/kg，添加濃度的回收率為70%~120%；噁喹酸、氟甲喹在10μg/kg~100μg/kg，添加濃度的回收率為70%~120%。
10.3精密度
本方法的批內(nèi)相對標準偏差≤15%，批間相對標準偏差≤15%。