丙酸蛛網(wǎng)菌pcr檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)使用方法:
一、樣品 dna 的制備
用自選方法提取 cps dna。注意：dna 純化方法是決定檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品 dna，后面的 pcr 再靈敏也不能提高整體檢測(cè)靈敏度。
二、制備 cps 標(biāo)準(zhǔn)曲線（以 10-10e6 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對(duì)照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的 dn**段作為陽性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2 和 1 號(hào)。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μl 超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 產(chǎn)品僅用于科研先將本試劑盒提供的陽性對(duì)照用 te 緩沖液或超純水 10 倍梯度稀釋到10e7 拷貝/μl（注：請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至 10e7拷貝/μl，建議每次稀釋 10 倍，梯度稀釋至 10e7 拷貝/μl）。
4. 在 6 號(hào)管中加入 5 μl 10e7 拷貝/μl 的 cps 陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10e6 拷貝/μl 的陽性對(duì)照。
5. 換槍頭，從 6 號(hào)管中取 5 μl 溶液到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 10e5拷貝/μl 的陽性對(duì)照。
6. 換槍頭，從 5 號(hào)管中取 5 μl 溶液到 4 號(hào)管中，重復(fù)上面的操作直到得到 6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。7. nc 管中不加任何陽性對(duì)照。
8. 從 1-6 號(hào)管中分別取 5 μl 和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量 pcr（見下步），每個(gè)樣品做 3 次重復(fù)。pcr 后得到每個(gè)陽性對(duì)照稀釋樣品的熒光 pcr ct 值，并以之為縱軸，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
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