對(duì)于做過(guò)分子實(shí)驗(yàn)的小伙伴來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)——酶切連接，大家應(yīng)該都是比較熟悉的，那么對(duì)于其他的分子克隆技術(shù)類(lèi)型大家有了解過(guò)嗎？根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，來(lái)選擇不同的分子克隆技術(shù)以及產(chǎn)品。本期，小愛(ài)帶大家一起來(lái)了解下幾種常規(guī)的分子克隆技術(shù)吧。
一、酶切連接
酶切連接法屬于經(jīng)典的分子克隆方法，利用限制性?xún)?nèi)切酶切割dna和利用dna連接酶連接dna，最后轉(zhuǎn)化篩選及純化，完成重組基因的大量制備。
圖1 酶切連接流程
成功的酶切和有效的連接是分子克隆實(shí)驗(yàn)圓滿(mǎn)完成的必要條件。限制性?xún)?nèi)切酶能特異性地結(jié)合于能被限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別的dna序列之內(nèi)或其附近的特異性位點(diǎn)上，并切割雙鏈dna。根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件以及是否有修飾酶活性，可分為ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型。分子克隆技術(shù)中常用的是ⅱ型酶，切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性dna。
粘性末端，即限制性?xún)?nèi)切酶在dna雙鏈上交錯(cuò)切割，形成的核苷酸順序互補(bǔ)的，可形成氫鍵的末端（見(jiàn)圖2）。
平齊末端，限制性?xún)?nèi)切酶在dna雙鏈的相同位置切割dna分子，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的dna片斷（見(jiàn)圖3）。
圖2 ecor i切割dna形成粘性末端dna片段
圖3 alui切割dna形成平末端dna片段
absin擁有目前常用的幾種限制性?xún)?nèi)切酶，包括快速內(nèi)切酶bsai(abs60206)、快速內(nèi)切酶clai(abs60209)、快速內(nèi)切酶ecori(abs60213)、快速內(nèi)切酶hindiii(abs60217)等四十多種。
absin限制性?xún)?nèi)切酶產(chǎn)品特點(diǎn)：
1、快速酶切：5-15min即可完成酶切；
2、通用的buffer：大大簡(jiǎn)化了酶切反應(yīng)；
3、高保真：極低的星號(hào)活性；
4、高度冗余：輕松應(yīng)對(duì)過(guò)量、復(fù)雜底物；
5、良好的兼容：經(jīng)驗(yàn)證所有absin快速內(nèi)切酶與其他品牌酶切體系相互兼容。
表1 absin限制性?xún)?nèi)切酶介紹
貨號(hào)
產(chǎn)品名稱(chēng)
規(guī)格
abs60200
快速內(nèi)切酶apali
200t
abs60201
快速內(nèi)切酶asci
50t
abs60202
快速內(nèi)切酶avrii
25t
abs60203
快速內(nèi)切酶bamhi
500t
abs60204
快速內(nèi)切酶bcli
125t
abs60205
快速內(nèi)切酶bglii
100t
abs60206
快速內(nèi)切酶bsai
50t
abs60207
快速內(nèi)切酶bstbi
100t
abs60208
快速內(nèi)切酶bsteii
100t
abs60209
快速內(nèi)切酶clai
50t
abs60210
快速內(nèi)切酶dpni
50t
abs60211
快速內(nèi)切酶dpnii
50t
abs60212
快速內(nèi)切酶eagi
25t
abs60213
快速內(nèi)切酶ecori
600t
abs60214
快速內(nèi)切酶ecorv
200t
abs60215
快速內(nèi)切酶esp3i(bsmbi)
30t
abs60216
快速內(nèi)切酶fspi
50t
abs60217
快速內(nèi)切酶hindiii
500t
abs60218
快速內(nèi)切酶hinfi
500t
abs60219
快速內(nèi)切酶hpai
50t
abs60220
快速內(nèi)切酶kpni
200t
abs60221
快速內(nèi)切酶mlui
100t
abs60222
快速內(nèi)切酶mnli
50t
abs60223
快速內(nèi)切酶ncoi
30t
abs60224
快速內(nèi)切酶ndei
200t
abs60225
快速內(nèi)切酶nhei
30t
abs60226
快速內(nèi)切酶noti
50t
abs60227
快速內(nèi)切酶nrui
50t
abs60228
快速內(nèi)切酶nsii
25t
abs60229
快速內(nèi)切酶paci
25t
abs60230
快速內(nèi)切酶psti
500t
abs60231
快速內(nèi)切酶pvuii
200t
abs60232
快速內(nèi)切酶saci
100t
abs60233
快速內(nèi)切酶sacii
50t
abs60234
快速內(nèi)切酶sali
200t
abs60235
快速內(nèi)切酶sbfi
25t
abs60236
快速內(nèi)切酶smai
100t
abs60237
快速內(nèi)切酶spei
50t
abs60238
快速內(nèi)切酶sphi
50t
abs60239
快速內(nèi)切酶sspi
60t
abs60240
快速內(nèi)切酶stui
100t
abs60241
快速內(nèi)切酶taqi
200t
abs60242
快速內(nèi)切酶xbai
500t
abs60243
快速內(nèi)切酶xhoi
500t
abs60244
內(nèi)切酶sgei
250u
核酸片段可以通過(guò)連接酶的作用連接起來(lái)而獲得重組分子。dna接酶催化雙鏈dna子中相鄰堿基的5’-p末端與3-0h間形成3’,5’-磷酸二酯鍵。常用的dna連接酶是t4 dna連接酶——t4 dna ligase(abs60084)，被稱(chēng)為生物界的“502”。在有mg2+和atp存在的條件下，t4 dna ligase能催化雙鏈dna或rna上相鄰的5′-磷酸末端和3′-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化雙鏈dna的平末端或粘性末端之間的連接，還可以修復(fù)雙鏈dna、rna或dna/rna雜交雙鏈中的單鏈切刻，但不能催化單鏈dna之間的連接。
圖4 t4 dna連接酶作用位點(diǎn)
二、ta克隆
ta克隆是指把pcr片段與一個(gè)具有3‘-t突出的載體dna連接起來(lái)的方法。可用于不清楚目的基因的dna序列，獲得的目的片段通常需要通過(guò)ta克隆的方法重組到t-載體中，通過(guò)測(cè)序測(cè)定dna序列。absin t-vector快速克隆試劑盒(abs60085)是高效、便利的pcr產(chǎn)物克隆專(zhuān)用試劑盒。
absin t-vector快速克隆試劑盒(abs60085)產(chǎn)品特點(diǎn)：
1、陽(yáng)性率高：高純度酶切型線性t載體，連接效率更高，藍(lán)斑率低于10% ；
2、方便快捷：預(yù)混連接反應(yīng)體系，最快5分鐘實(shí)現(xiàn)連接，無(wú)需純化，直接轉(zhuǎn)化；
3、t simple載體無(wú)常用酶切位點(diǎn)，利于含酶切位點(diǎn)基因克??；
4、無(wú)ndei或ncoi位點(diǎn)，便于重組表達(dá)基因的克??；
5、提供純化的pcr片段作為陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照；
6、藍(lán)白篩選：高表達(dá)活性的β-半乳糖苷酶，顯色更快更深；
7、批次穩(wěn)定：遵循標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)流程，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)。
圖5 ta克隆流程
三、無(wú)縫克隆
無(wú)縫克隆技術(shù)是一種新的、快速、簡(jiǎn)潔的克隆方法，可以在質(zhì)粒的任何位點(diǎn)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)dna的片斷的插入，而不需要任何限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶，只需要一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體，大大提高了工作效率。absin快速多片段dna組裝預(yù)混液(abs60250)就是基于重組原理的無(wú)縫克隆技術(shù)，它不依賴(lài)繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補(bǔ)平等操作，依據(jù)dna片段與線性化載體末端的15~25nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點(diǎn)，載體自連背景極低，是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的dna定向克隆技術(shù)。
absin快速多片段dna組裝預(yù)混液(abs60250)特點(diǎn)：
1、簡(jiǎn)單便捷：兼容pcr產(chǎn)物體系與載體酶切體系，省去繁瑣的純化步驟；
2、高陽(yáng)性率：定向克隆單個(gè)dna片段至載體上，陽(yáng)性率高于95%；
3、快速反應(yīng)：反應(yīng)時(shí)間大大縮短，最快僅需5min；
4、單/多片段均可連接：?jiǎn)蝹€(gè)或多個(gè)片段同時(shí)插入，省去重復(fù)純化與酶切過(guò)程。
圖6 absin快速多片段dna組裝預(yù)混液(abs60250)無(wú)縫克隆操作流程
四、topo克隆
topo克隆實(shí)際是基于拓?fù)洚悩?gòu)酶的克隆技術(shù)，關(guān)鍵是拓?fù)洚悩?gòu)酶。該技術(shù)不需要限制性?xún)?nèi)切酶或外源連接酶，從而提供了將新的pcr產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中的極其簡(jiǎn)便快捷的方法。
topo克隆產(chǎn)品特點(diǎn)：快捷，不需連接酶，克隆三步到位。
表2 愛(ài)必信topo克隆產(chǎn)品
貨號(hào)
產(chǎn)品名稱(chēng)
規(guī)格
abs60091
t-vector ptopo快速克隆試劑盒
20t/100t
abs60094
blunt ptopo快速克隆試劑盒
20t/100t
abs60095
pbm16a toposmart快速克隆試劑盒
20t/3×20t
abs60096
pbm27 toposmart快速克隆試劑盒
20t/3×20t
五、geteway克隆
geteway克隆利用位點(diǎn)特異重組實(shí)現(xiàn)目的片段的插入的，載體上的一段目的片段在重組酶的作用下會(huì)替換成目的片段，不依賴(lài)限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶，導(dǎo)入目的基因不需要開(kāi)環(huán)處理，載體需要用試劑盒提供的載體，一般需要用到兩個(gè)載體，快速、高效將dna序列轉(zhuǎn)移到載體上的克隆。
absin特色產(chǎn)品線：
wb相關(guān)：ecl發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；ihc相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；ip/coip試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、bsa、蛋白酶k、ctb、ttx、cee；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；elisa試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...