雜交捕獲家族“核心成員”大揭秘！
近年來，高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速，測序成本也在逐漸降低。但就現(xiàn)階段而言，全基因組測序的成本依然很高，且測序之后得到的龐大數(shù)據(jù)量也導致數(shù)據(jù)分析速度緩慢。與全基因組測序相比，靶向捕獲測序可以針對感興趣的區(qū)域進行富集，單個樣本所需測序數(shù)據(jù)量顯著降低且分析速度更快。不僅如此，靶向測序還可以對目標區(qū)域進行深度測序，在遺傳突變檢測、腫瘤篩查等領域，相同測序成本下靶向捕獲測序能達到更高的靈敏度。
圖1 .3種測序方法簡單對比
靶向捕獲包含雜交捕獲、多重pcr和分子倒置探針捕獲。和pcr以及分子倒置探針捕獲（mip）方法相比，雜交捕獲具有捕獲區(qū)段大（可達幾百mb）和探針均一性好的優(yōu)勢。
均一性是評價捕獲技術(shù)很關(guān)鍵的參數(shù)，均一性好后續(xù)測序成本就會下降。缺點是容易捕獲非目標片段，造成成本增加。因為雜交前樣本會被隨機打斷到比較合適的長度，探針捕獲時可能和目標片段部分雜交，導致一些含有部分目標區(qū)段的文庫被捕獲。所以雜交捕獲的特異性較差，容易捕獲非目標區(qū)段。
圖2.靶向捕獲技術(shù)優(yōu)劣勢對比圖
根據(jù)探針的狀態(tài)和雜交狀況不同雜交捕獲分為固態(tài)雜交和液態(tài)雜交。固相雜交捕獲法是先選定目標dna區(qū)域，在芯片上修飾與目標區(qū)域互補的探針，隨后在芯片上進行dna與探針的雜交反應，最后將與探針雜交的dna洗脫下來用于后續(xù)的測序工作。液相雜交捕獲技術(shù)是根據(jù)核酸分子堿基互補配對原理，在溶液中生物素標記的探針與靶區(qū)域特異性結(jié)合，通過鏈霉親和素磁珠對探針捕獲到的目的片段進行富集的技術(shù)。
固相雜交由于其在花費與操作上的劣勢，已基本被淘汰，液相雜交捕獲法是目前被廣泛應用的靶向測序方法，具有探針設計難度低、探針容錯性高等優(yōu)點。
圖3 .固（左）/液（右）相雜交捕獲原理圖
在液相捕獲過程中，還有2個的角色接頭序列封阻劑（universal blocker）和重復序列封阻劑（cot-1 dna）。其中，universal blocker含有修飾堿基，可針對不同的index序列進行封閉；cot-1 dna來源于人胎盤中提取的基因組dna，為人基因組中長約50至300 bp的高度重復序列，能夠方便、有效地對待檢測樣品核酸序列中的重復序列進行封閉，屏蔽重復序列，從而避免核酸雜交過程中非特異性信號的干擾。兩種封阻劑共同作用，最終實現(xiàn)對待檢測核酸樣本中核酸序列的有效捕獲。
圖4.2種封閉試劑的作用原理
cot-1最早是在核酸雜交實驗中，用來避免探針的非特異性結(jié)合所導致的背景噪音。具體到液相雜交捕獲實驗中，探針雖然是人為設計的序列，可以避免探針和高拷貝/重復性序列的結(jié)合，但當cot-1不足時，探針和文庫還是會產(chǎn)生一定數(shù)量的氫鍵而實現(xiàn)非特異性地結(jié)合，即使這種結(jié)合并不非常充分，或者只有部分區(qū)域的結(jié)合，但這種結(jié)合會導致捕獲特異性顯著下降。
universal blocker的作用相對明確，就是阻止不同文庫分子通過adapter之間的互補序列產(chǎn)生結(jié)合。
圖5.cot-1和blocker不足時非特異結(jié)合示意圖
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產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品編號
產(chǎn)品應用
hieff ngs® human all exon probes
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