標簽：熒光檢測，熒光強度， 熒光定量pcr， 定量pcr，熒光筆
熒光定量pcr是pcr實驗中常見的pcr類型，下面歸納一下，客戶進行pcr實驗時常遇見的一些問題。希望對具有pcr恐懼癥的伙伴們能有所幫助。
常見問題一： 熒光定量pcr的類型有幾種？有何區(qū)別？
答：目前熒光定量pcr實驗常用的方法主要有兩種，即：sybr green i染料法和taqman探針法，兩者的主要區(qū)別在于：sybr green染料的特點是只與dna雙鏈相結(jié)合發(fā)出熒光，而當熒光染料處在游離狀態(tài)時，不會發(fā)出熒光。所以在pcr循環(huán)體系中熒光信號強度與pcr產(chǎn)物的數(shù)量成正比例關(guān)系。染料法熒光定量的優(yōu)點是通用性比較強，幾乎適用于所有的熒光定量pcr反應但也具有明顯非特異性。如果pcr反應過程中出現(xiàn)引物二聚體或者進行非特異性擴增時，該染料也會這些非特異性擴增產(chǎn)物結(jié)合從而激發(fā)熒光，形成假陽性信號，對pcr定量結(jié)果一定的干擾，從而影響到pcr定量結(jié)果的準確性。
常見問題二：熒光定量實驗中無擴增曲線是什么原因?qū)е拢?br> 答：一般來說，在熒光定量pcr實驗中，無擴增曲線主要會有以下三種情況：
凝膠電泳時無條帶出現(xiàn)，無擴增曲線。
這種情況需要考慮引物的設(shè)計是否合理？引物質(zhì)量是否正常？退火溫度設(shè)置是否合理？擴增體系是否正常等等。
2.第二種情況比較容易出現(xiàn)的是在做電泳時會正常顯示條帶，但沒有明顯的擴增曲線。這種情況有可能是探針合成過程出現(xiàn)問題；如果探針過程正常，則需要檢查探針淬火溫度、程序參數(shù)設(shè)定問題確排除后則可能是儀器故障導致。
3.另外，模板被降解或模板不足時也會出現(xiàn)無曲線擴增現(xiàn)象。
常見問題三：熒光定量pcr時，有哪些需要注意的？
答：在進行熒光定量pcr實驗室時，需要注意以下幾點：
1.pcr實驗室要有獨立的分區(qū)：一般pcr實驗室的樣品處理區(qū)、pcr反應制備區(qū)、pcr擴增區(qū)，數(shù)據(jù)報告區(qū)等相互獨立使用放置dna污染；
2.配置標準品的工具，包括移液器、吸頭等單獨使用一套工具，并且移液器的吸頭是帶濾芯的標準吸頭。
3.盡量不要用記號筆或標簽在pcr管上做標記，以免影響儀器的熒光檢測4.pcr管或8排管使用完后，及時歸入在的廢棄放置區(qū)，不要與試驗區(qū)域內(nèi)的樣本混用。
5.每個步驟都需要做好防止dna貨rna污染措施。
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