黃qu霉毒素 m1 是牛奶中主要的一種黃qu霉毒素。歐盟委員會(huì) (ec) 規(guī)定歐洲嬰兒配 方奶中該物質(zhì)的大濃度為 0.025 µg/kg。在美國，食品和* (fda) 規(guī)定 牛奶中黃qu霉毒素的干預(yù)濃度為 0.5 µg/kg。本應(yīng)用簡報(bào)介紹了采用 agilent bond elut 增強(qiáng)型脂質(zhì)去除產(chǎn)品 emr-lipid 通過 lc/ms/ms 對嬰兒配方奶中的黃qu霉毒素 m1、g2、 g1、b2 和 b1 進(jìn)行測定。本研究首先采用 quechers 萃取，然后采用 emr-lipid 分散 式固相萃取 (dspe) 進(jìn)行凈化。該方法可使所有濃度的所有黃qu霉毒素實(shí)現(xiàn)出色的回收 率 (88%-113%) 與精密度 (rsd = 1.3%-13.6%)。由于充分的基質(zhì)去除，其定量限 (loq) 要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于美國和歐洲的法規(guī)限值。這一簡單而穩(wěn)定的方法僅需極少設(shè)備和專業(yè)技術(shù)， 因此可在食品實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn)輕松應(yīng)用
真菌毒素是真菌的次生代謝產(chǎn)物，是食品和飼料供應(yīng)中常 見的污染物之一。糧食及農(nóng)業(yè)組織 (fao) 估計(jì)世界上有多 達(dá) 25% 的農(nóng)產(chǎn)品受到了真菌毒素的污染。這種污染會(huì)造成災(zāi)難 性的經(jīng)濟(jì)損失，對糧食產(chǎn)業(yè)而言更是如此 [1]。黃qu霉毒素（表 1） 是由多種真菌（特別是黃qu霉和寄生曲霉）產(chǎn)生的一類真菌毒 素 [2]。黃qu霉毒素 m1 是牛奶中常見的真菌毒素，奶牛食用 了受黃qu霉毒素 b1 污染的飼料并對其進(jìn)行代謝后即可產(chǎn)生黃qu霉毒素 m1 [3]。美國食品和* (fda) 以及歐盟委 員會(huì) (ec) 均已對多種食品中的黃qu霉毒素限值進(jìn)行了規(guī)定 [4,5]。 表 2 總結(jié)了美國和歐洲的 fda 和 ec 黃qu霉毒素限值。
黃qu霉毒素的法規(guī)限值極低，在嬰兒食用的乳制品基質(zhì)和配方奶 中更是如此。為去除基質(zhì)干擾以增強(qiáng)低濃度下的分析物信號(hào)，樣 品前處理*。通常使用免疫親和柱分析多種包括黃qu霉毒 素在內(nèi)的真菌毒素 [6-9]。但這類色譜柱價(jià)格昂貴，并需要采用 對食品實(shí)驗(yàn)室來說并不方便的*的多種工作流程?？焖?、簡便、 經(jīng)濟(jì)、、耐用和安全的 quechers 方法針對樣品采用簡單的 三步流程（萃取、凈化和分析）。因此，該方法在谷物和乳制品 中包括黃qu霉毒素在內(nèi)的多種不同分析物和基質(zhì)的前處理方面極 具前景 [3,10,11]。但通過 c18 或 psa 進(jìn)行的 quechers 凈化 在分析肉類和牛奶等含有大量脂質(zhì)的樣品時(shí)有一定限制。這種限 制來自于與目標(biāo)分析物的非選擇性相互作用以及幾乎無法去除的 主要脂類物質(zhì)。所有殘留的脂質(zhì)均會(huì)聚集于分析流路中，從而導(dǎo) 致維護(hù)次數(shù)增加、色譜圖異常，并大大降低數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度和精密度。
agilent bond elut 增強(qiáng)型脂質(zhì)去除產(chǎn)品 emr-lipid 是一種新型 吸附劑，該產(chǎn)品結(jié)合了*的體積排阻和疏水相互作用，可選擇 性去除樣品中的主要脂類，且不會(huì)保留不需要的其他分析物。這 種吸附劑可用于通過 quechers 進(jìn)行的 dspe 凈化以及蛋白質(zhì) 沉淀工作流程，有助于實(shí)現(xiàn)簡單的凈化 [12,13]。本研究對 嬰兒配方奶中的五種黃qu霉毒素進(jìn)行了分析。嬰兒配方奶富含脂 質(zhì)且有明確的黃qu霉毒素法規(guī)限值，因此選擇它作為基質(zhì)。在 quechers 萃取后進(jìn)行 emr-lipid dspe 凈化，并使用無水 mgso4 進(jìn)行增強(qiáng)的樣品（凈化）后處理（步驟），可獲得出色的 基質(zhì)去除效果。本應(yīng)用簡報(bào)證實(shí)了 emr-lipid 在三種不同濃度的 黃qu霉毒素分析中的有效性。
實(shí)驗(yàn)部分 試劑與化學(xué)品 所有試劑均為 hplc 級(jí)或更高等級(jí)。乙腈 (acn) 和甲醇購自 honeywell (muskegon, mi, usa)。水的凈化處理由 emd millipore milli-q integral 系統(tǒng) (darmstadt, germany) 完成。試劑級(jí)甲酸 （fa，部件號(hào) g2453-85060）來自安捷倫科技公司。歐洲標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì) erm-bd283（含低濃度黃qu霉毒素 m1 的全脂奶粉）購自 lgc standards (teddington, middlesex, uk)。黃qu霉毒素 m1 （10 µg/ml，溶于乙腈）、黃qu霉毒素混合物（b1、g1、b2、 g2：均為 20 µg/ml，溶于乙腈）以及甲酸銨購自 sigma-aldrich 公司 (st. louis, mo, usa)。根據(jù)生廠商的建議，黃qu霉毒素標(biāo) 準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別在 2-8 °c (m1) 以及 -20 °c（b1、b2、g1、g2 混合物）下儲(chǔ)存。液態(tài)即食嬰兒配方奶購自當(dāng)?shù)仉s貨店。
設(shè)備 所用的儀器與材料： • eppendorf 移液器和連續(xù)分液器 • 渦旋儀和多管渦旋儀 (vwr, radnor, pa, usa) • geno/grinder (spex, metuchen, nj, usa) • centra cl3r 離心機(jī) (thermo iec, ma, usa) • turbovap lv (biotage, charlotte, nc, usa) • eppendorf 微量離心機(jī) (brinkmann instruments, westbury, ny, usa) • agilent bond elut 早期 quechers 方法（無緩沖鹽）萃取試 劑盒（10 g 樣品），配有陶瓷均質(zhì)子（部件號(hào) 5982-5550ch） • agilent bond elut emr-lipid dspe 增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管 （部件號(hào) 5982-1010） • agilent bond elut emr-lipid polish mgso4 反萃管（部件號(hào) 5982-0102）
儀器 采用 agilent 1290 infinity lc 進(jìn)行分析，其中包括： • agilent 1290 infinity 二元泵 (g4220a) • 配備 agilent 1290 fc/als 溫控裝置 (g1330b) 的 agilent 1290 infinity 高性能自動(dòng)進(jìn)樣器 (g4226a) • agilent 1290 infinity 柱溫箱 (g1316c) 該液相色譜系統(tǒng)聯(lián)用配備安捷倫噴射流電噴霧離子化技術(shù)的 agilent 6460a 三重四極桿 lc/ms/ms 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。采用 agilent masshunter 工作站軟件進(jìn)行所有的數(shù)據(jù)采集和分析。
樣品前處理 取液態(tài)嬰兒配方奶 (10 ml) 加入 50 ml 離心管中，并添加適量 標(biāo)準(zhǔn)品作為質(zhì)量控制 (qc) 樣品。加入兩粒陶瓷均質(zhì)子及 10 ml 乙腈，然后將樣品渦旋混合 2 分鐘。在樣品中加入早期（非緩沖 鹽，10 g 樣品）quechers 萃取鹽包。在機(jī)械振蕩器中將樣品混合 2 分鐘，然后在 5000 rpm 下離心 5 分鐘。在 emr-lipid dspe 增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管中加入 5 ml 水，然后加入 5 ml 樣品粗 提物。立即對樣品進(jìn)行渦旋混合，然后用多管渦旋儀繼續(xù)渦旋混 合 60 秒。將樣品在 5000 rpm 下離心 5 分鐘，然后將其倒入另一 個(gè)空的 15 ml 離心管中。將 polish 除脂萃取鹽包中的無水硫酸 鎂 (mgso4) 加入萃取液中。立即將樣品渦旋混合 60 秒以分散其 中的鹽，然后以 5000 rpm 離心 3 分鐘。將上清液移至含有 1.5 g mgso4（來自新的 polish 除脂萃取鹽包）的 15 ml 離心管中。立 即對樣品進(jìn)行渦旋混合，然后再次渦旋混合 60 秒。以 5000 rpm 離心 3 分鐘后，將終樣品 (1 ml) 轉(zhuǎn)移至一個(gè) 16 × 100 mm 的 玻璃試管中，并在 50 °c 下用氮?dú)獯蹈?。吹干前需要向空白基質(zhì) 中加入校準(zhǔn)標(biāo)樣。用 100 µl 含有 0.1% 甲酸/乙腈 (80/20) 的水 對樣品進(jìn)行復(fù)溶，并渦旋混合至少 2 分鐘。然后對樣品進(jìn)行超聲 處理與離心（如需要）。將終樣品轉(zhuǎn)移至帶內(nèi)襯管的樣品瓶中 進(jìn)行 lc/ms/ms 分析。圖 1 展示了整個(gè)樣品前處理過程。
校準(zhǔn)標(biāo)樣和質(zhì)量控制 將儲(chǔ)備液用乙腈稀釋制得黃qu霉毒素工作溶液，濃度分別為 2 µg/ml（黃qu霉毒素 m1）和 10 µg/ml（黃qu霉毒素 g2、g1、 b2 和 b1）。為滿足不同的法規(guī)限值要求，黃qu霉毒素 m1 的濃 度比其他黃qu霉毒素的濃度低 5 倍。通過對工作溶液進(jìn)行適當(dāng)稀 釋而制得 100x 終濃度的校準(zhǔn)品和 qc 標(biāo)準(zhǔn)品。表 4 列出了嬰 兒配方奶中校準(zhǔn)品和 qc 樣品的終濃度。將工作溶液、所有校 準(zhǔn)品及所有 qc 標(biāo)準(zhǔn)品均置于棕色瓶于 2-8 °c 下儲(chǔ)存。在萃取前， 向基質(zhì)空白嬰兒配方奶中加入 100 µl 的相應(yīng) qc 標(biāo)準(zhǔn)品。而對 于基質(zhì)匹配校準(zhǔn)標(biāo)樣，在吹干前向 990 µl 的基質(zhì)空白乙腈萃取液 中加入 10 µl 適當(dāng)校準(zhǔn)標(biāo)樣。
結(jié)果與討論 方法優(yōu)化 emr-lipid 可用于蛋白質(zhì)沉淀和 quechers 工作流程中。初步 測試表明，蛋白質(zhì)沉淀和 quechers 流程均適用于液態(tài)嬰兒配方 奶中的黃qu霉毒素分析。而由于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)沉淀過程中的稀釋因 子較大，故在本應(yīng)用中選擇 quechers 方法。在進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)后， 對本應(yīng)用選擇了早期 quechers 萃取鹽，但 aoac 與 en 萃取 鹽均適用。根據(jù)信噪比 (s/n) 標(biāo)準(zhǔn)得知，為達(dá)到黃qu霉毒素 m1 的預(yù)期定量 限 (loq)，需要對樣品采用濃縮步驟。分別對 5x、10x 和 20x 濃 度進(jìn)行評(píng)估后發(fā)現(xiàn)，在給定的儀器設(shè)置下，10x 濃度可滿足 loq 和方法的需求。圖 2 展示了在經(jīng)過 quechers 萃取、emr-lipid 凈化以及采用 mgso4 的增強(qiáng)的樣品（凈化）后處理（步驟），嬰 兒配方奶中黃qu霉毒素的 lc/ms/ms dmrm 色譜圖。