壓縮是正畸牙齒移動(dòng)（otm）期間正畸壓縮力（cf）誘導(dǎo)的特定微環(huán)境的標(biāo)志之一，因?yàn)樗軌蛴绊懗裳拦琴|(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在otm期間，壓縮力會(huì)觸發(fā)牙周膜（pdl）的炎癥性破骨細(xì)胞生成和重塑過程，以進(jìn)一步產(chǎn)生免疫抑制性缺氧微環(huán)境，從而損害otm的過程。由于正畸誘導(dǎo)的炎癥性牙根吸收（oiirr）是正畸牙齒移動(dòng)的一種嚴(yán)重副作用，因此壓縮力對(duì)牙骨質(zhì)生理學(xué)的作用越來越受到關(guān)注。成牙骨質(zhì)細(xì)胞是調(diào)節(jié)牙骨質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及通過參與先天免疫防御來預(yù)防oiirr的負(fù)責(zé)細(xì)胞群。因此，這些細(xì)胞在基礎(chǔ)正畸研究中得到了深入研究，特別是關(guān)于它們對(duì)正畸壓縮力或牙周病原體及其成分（如肽聚糖）的反應(yīng)。
牙齦卟啉單胞菌（p. gingivalis）是一種革蘭陰性厭氧菌，被認(rèn)為是慢性牙周炎進(jìn)展的關(guān)鍵病原體之一。牙齦卟啉單胞菌細(xì)胞壁的一個(gè)組成部分是肽聚糖（pgn）。牙齦卟啉單胞菌pgn是一種普遍存在的細(xì)菌成分，盡管它具有強(qiáng)大的促炎特性，但也可能在免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮作用。已知它可以刺激人牙齦角質(zhì)形成細(xì)胞中豐富的pd-l1蛋白表達(dá)，但這尚未在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中得到證實(shí)。重要的是，牙周致病菌之一的牙齦卟啉單胞菌與正畸力（cf）相互作用的分子和細(xì)胞機(jī)制在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中尚不了解。
缺氧誘導(dǎo)的pd-l1表達(dá)已在多種原發(fā)性和各種癌細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)。缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（hif）是正畸力轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，據(jù)報(bào)道可調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的凋亡過程。然而，目前尚不清楚hif-1α是否調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細(xì)胞中 pd-l1 的表達(dá)。去年，德國(guó)尤斯圖斯·李比希吉森大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔正畸學(xué)系、牙周病學(xué)系的一項(xiàng)研究觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了理解pd-l1表達(dá)在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中如何調(diào)節(jié)的機(jī)制的重要性。
牙齦卟啉單胞菌 pgn 觸發(fā)成牙骨質(zhì)細(xì)胞中 pd-l1 的上調(diào)
首先，實(shí)驗(yàn)采用所有方法驗(yàn)證了不同濃度的牙齦卟啉單胞菌pgn感染后pd-l1在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的動(dòng)力學(xué)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用牙齦卟啉單胞菌pgn刺激成牙骨質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致pd-l1蛋白表達(dá)以濃度依賴性方式上調(diào)，在100 μg/ml時(shí)達(dá)到峰值。pd-l1的if染色結(jié)果顯示，牙齦卟啉單胞菌pgn（100 μg/ml）感染細(xì)胞中pd-l1的表達(dá)明顯高于未受刺激細(xì)胞。rt-qpcr基因表達(dá)分析顯示，100 μg/ml牙齦卟啉單胞菌pgn 刺激24 h后，pd-l1 mrna水平明顯高于孵育開始時(shí)間點(diǎn)（0）。
這些數(shù)據(jù)表明，牙齦卟啉單胞菌pgn以劑量和時(shí)間依賴性方式顯著上調(diào)了成牙骨質(zhì)細(xì)胞中的pd-l1分子表達(dá)，從4小時(shí)開始，在8小時(shí)后達(dá)到峰值，然后在12小時(shí)后衰減至48小時(shí)。
壓縮力觸發(fā) occm-30 細(xì)胞中 pd-l1 和 hif-1α 的表達(dá)
由于壓縮是正畸誘導(dǎo)微環(huán)境的主要組成部分之一，因此，首先在永生化小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞系occm-30上研究cf對(duì)免疫檢查點(diǎn)之一的程序性死亡受體配體1（pd-l1）表達(dá)的影響。結(jié)果表明，載荷量為 2.4 gf/cm2 的cf在8、12和24小時(shí)內(nèi)顯著增加了pd-l1 在mrna和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)（圖1 b、c）。同樣，通過pd-l1的免疫熒光染色可見，cf組表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)（圖1 d）。
進(jìn)一步研究了cf是否可以誘導(dǎo)occm-30細(xì)胞中的hif-1α表達(dá)。結(jié)果表明，cf顯著增加了成牙骨質(zhì)細(xì)胞中hif-1α蛋白和基因的表達(dá)。還觀察到hif-1α在壓縮細(xì)胞中含量豐富。
因此，這些結(jié)果表明，壓縮力導(dǎo)致成牙骨質(zhì)細(xì)胞中pd-l1輕微上調(diào)，促進(jìn)了hif-1α的表達(dá)。
圖1 響應(yīng)壓縮力的occm-30細(xì)胞中pd-l1和hif-1α的上調(diào)。
用正畸力（2.4 gf/cm2）壓縮成牙骨質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，在不同時(shí)間段（1，2，4，6，8，12和24小時(shí)）。（a）生理細(xì)胞培養(yǎng)條件和受壓縮力（cf）刺激的細(xì)胞的照片。（b、c）通過免疫印跡法測(cè)定pd-l1蛋白表達(dá)，并通過if染色檢測(cè)其定位。（d）在特定時(shí)間點(diǎn)壓縮力下培養(yǎng)的occm-30細(xì)胞中pd-l1基因表達(dá)的rt-qpcr定量。（e、f）通過蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定hif-1α蛋白表達(dá)。采用if法評(píng)估hif-1α定位。（g）在特定時(shí)間壓縮力下培養(yǎng)的occm-30細(xì)胞中hif-1α基因表達(dá)的rt-qpcr定量。
壓縮介導(dǎo)牙齦卟啉單胞菌pgn觸發(fā)的pd-l1在成牙骨質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)
wb分析顯示，pd-l1在牙齦卟啉單胞菌pgn感染的成牙骨質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)（圖2 a-d）。重要的是，特別是在與cf和牙齦卟啉單胞菌pgn共刺激24小時(shí)后，pd-l1蛋白表達(dá)增強(qiáng)。與對(duì)照組（7.19±0.60%）相比，牙齦卟啉單胞菌 pgn或cf也增加了壞死性凋亡的比例（分別為11.22±0.75%；14.79±1.84%）（圖2 e、f）。牙齦卟啉單胞菌pgn聯(lián)合cf顯著增加成牙骨質(zhì)細(xì)胞壞死性凋亡（39.55±4.51%）（圖2 e、f）。這些結(jié)果表明，壓縮力可以調(diào)節(jié)牙齦卟啉單胞菌pgn誘導(dǎo)的pd-l1表達(dá)并參與成牙骨質(zhì)細(xì)胞的壞死性凋亡。
圖2 壓縮力以及牙齦卟啉單胞菌pgn觸發(fā)pd-l1表達(dá)并參與壞死性凋亡調(diào)節(jié)。在存在或不存在壓縮力（2.4 gf/cm2）的情況下，用確定濃度的牙齦卟啉單胞菌pgn（100 μg/ ml）處理成牙骨質(zhì)細(xì)胞。（a-d）在存在或不存在cf的情況下，pd-l1在牙齦卟啉單胞菌pgn處理的細(xì)胞上表達(dá)水平的蛋白質(zhì)印跡分析。（e、f）通過流式細(xì)胞術(shù)分析顯示了膜聯(lián)蛋白-v fitc和pi染色的代表性圖。壞死性凋亡率（annexin-v fitc+/pi+）顯示在右上象限。圖形顯示了在存在或不存在壓縮力的情況下，暴露于牙齦卟啉單胞菌pgn的壞死性凋亡細(xì)胞的百分比。
壓縮作用下牙齦卟啉單胞菌pgn誘導(dǎo)的pd-l1和hif-1α在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中的相關(guān)性
為了探討牙齦卟啉單胞菌pgn誘導(dǎo)的pd-l1表達(dá)是否依賴于hif-1α，使用了hif-1α抑制劑idf11774。wb結(jié)果表明，hif-1α在壓縮作用下的阻斷顯著消除了牙齦卟啉單胞菌pgn誘導(dǎo)的pd-l1蛋白上調(diào)（圖3 a、b）。if染色顯示，在牙齦卟啉單胞菌pgn刺激下，抑制 hif-1α對(duì)誘導(dǎo)性pd-l1表達(dá)具有顯著抑制作用（圖3 c）。此外，在與idf11774共刺激24小時(shí)后，觀察到細(xì)胞壞死性凋亡（圖3 c、d）。在存在壓縮力的情況下，idf11774增加了壞死性凋亡細(xì)胞的百分比。牙齦卟啉單胞菌pgn加cf組壞死性凋亡細(xì)胞的百分比也有所增加（圖3 e）。因此，這些證據(jù)表明，hif-1α是壓縮力下牙齦卟啉單胞菌pgn誘導(dǎo)的pd-l1 mrna和蛋白質(zhì)表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子。
圖3 牙齦卟啉單胞菌pgn誘導(dǎo)的pd-l1表達(dá)取決于occm-30細(xì)胞在壓縮力下的hif-1α信號(hào)。將occm-30細(xì)胞與不同濃度的hif-1α抑制劑idf11774預(yù)孵育2 h，然后分別用牙齦卟啉單胞菌pgn結(jié)合壓縮力刺激24 h。
（a、b）響應(yīng)idf11774（20 um）的pd-l1蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡分析。（c）代表性if染色顯示24小時(shí)后pd-l1在存在或不存在idf11774的情況下在牙齦卟啉單胞菌pgn刺激的occm-30細(xì)胞中表達(dá)。（d、e）計(jì)算暴露于hif抑制劑的壞死性凋亡細(xì)胞的百分比以及與牙齦卟啉單胞菌pgn和cf共同刺激的壞死性凋亡細(xì)胞的百分比。（f）occm-30細(xì)胞可以在體外釋放可溶性gas-6，如果hif-1α被抑制劑阻斷，這種作用就會(huì)受損。此外，牙齦卟啉單胞菌pgn誘導(dǎo)的gas-6釋放被hif-1α阻斷劑拮抗。
hif-1α 通過減少 gas-6 分泌參與成牙骨質(zhì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)
據(jù)描述，可溶性gas-6在pdl細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。因此，實(shí)驗(yàn)旨在分析occm-30細(xì)胞是否可以釋放gas-6，并且在存在或不存在hif-1α抑制劑的情況下，通過與牙齦卟啉單胞菌pgn和/或cf的共同刺激是否可以改變其表達(dá)。結(jié)果表明，occm-30細(xì)胞具有釋放gas-6（27.67 ±11.15 pg/ml）的特性，并且該釋放對(duì)idf11774（18.04 ± 8.43 pg/ml）的使用無顯著影響（圖3 f）。用牙齦卟啉單胞菌pgn處理不會(huì)改變gas-6的產(chǎn)生。有趣的是，在cf和cf加牙齦卟啉單胞菌pgn刺激條件下，idf11774導(dǎo)致gas-6的釋放分別降低至10.72±1.82 pg/ml和19.33±8.84 pg/ml。因此，這些結(jié)果表明，gas-6是成牙骨質(zhì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)劑，可以通過hif-1α被釋放和調(diào)節(jié)。
圖4 該方案描述了hif-1α在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中的作用方式：牙齦卟啉單胞菌pgn刺激了成牙骨質(zhì)細(xì)胞的pd-l1上調(diào)。壓縮力誘導(dǎo)occm-30細(xì)胞表達(dá)hif-1α和pd-l1。牙齦卟啉單胞菌pgn和壓縮力的共刺激調(diào)節(jié)pd-l1表達(dá)，增加occm-30細(xì)胞壞死凋亡比。抑制hif-1α可抑制pd-l1表達(dá)以及可溶性gas-6的產(chǎn)生。因此，hif-1α在壓縮力作用下調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細(xì)胞中pgn-誘導(dǎo)的pd-l1表達(dá)中起重要作用。
基于體外小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞模型，該研究表明，牙齦卟啉單胞菌pgn上調(diào)了成牙骨質(zhì)細(xì)胞的pd-l1，并且這種效果通過hif-1α響應(yīng)壓縮力而維持。激活hif-1α調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的壞死性凋亡。阻斷hif-1α可通過減少gas-6釋放來消除成牙骨質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
該數(shù)據(jù)表明，在正畸誘導(dǎo)的微環(huán)境下，免疫檢查點(diǎn)pd-l1與hif-1α在成牙骨質(zhì)細(xì)胞免疫抑制中相關(guān)。此外，通過使用hif-1α和pd-l1靶向抑制，在otm期間對(duì)牙周炎個(gè)體進(jìn)行oiirr的免疫治療可能有助于免疫反應(yīng)。
參考文獻(xiàn)：yong j, gr?ger s, meyle j, ruf s. immunorthodontics: role of hif-1α in the regulation of (peptidoglycan-induced) pd-l1 expression in cementoblasts under compressive force. int j mol sci. 2022 jun 23;23(13):6977. doi: 10.3390/ijms23136977. pmid: 35805974; pmcid: pmc9266671.