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        基因組DNA提取純化的注意事項(xiàng)

        發(fā)布時(shí)間:2024-08-19
        組織樣本 dna 純化
        大多數(shù)動(dòng)物組織可以用裂解緩沖液和蛋白酶/蛋白酶 k 進(jìn)行效裂解。在加入裂解液之前需要將組織切成小塊,有條件的話建議使用 tissuelyser 或研缽等提前進(jìn)行均質(zhì)化。骨骼肌,心臟,皮膚等組織含有收縮蛋白,結(jié)締組織和膠原蛋白,所以利用蛋白酶 / 蛋白酶 k 進(jìn)行充分消化是必須的。
        ffpe 樣本進(jìn)行 dna 純化時(shí)需要預(yù)裂解。福爾馬林可由 pbs 洗滌除去,石蠟可由甲苯和乙醇進(jìn)行去除。在蛋白酶消化后提孵育的溫度有助于逆轉(zhuǎn)交聯(lián),以便更好的從 ffpe 組織中釋放 dna,從而有助于提 dna 產(chǎn)量和改善下游檢測(cè)性能。 從 ffpe 中得到的 dna 通常比從新鮮或凍存樣本中得到的 dna 分子量??;dna 降解的程度則取決于樣本類型,儲(chǔ)存時(shí)間和固定的條件。
        從微量樣本中純化 dna
        微量樣本中 dna 的含量很低,通常小于 5 ng dna, 通常需要使用 carrier rna 來提產(chǎn)量(不會(huì)影響下游分析檢測(cè))。如果需要使用 carrier rna,那么在測(cè)量 od 的時(shí)候會(huì)因?yàn)槭褂?carrier rna 造成濃度測(cè)量有偏差(因?yàn)?rna 在 260 nm 也有吸收)。
        推薦使用 qiaamp dna micro kit 從微量樣本中進(jìn)行 dna 純化,該試劑盒采用 minelute 硅膠膜柱,洗脫體積可以低至 20 μl,同時(shí)通過兩步洗滌去除 pcr 抑制劑等污染物,大程度從微量樣本中純化 dna。
        從血液樣本中純化 dna
        血液樣本可以是新鮮或凍存全血或干血片,由于血液樣本在采集后會(huì)迅速凝固,所以通常在采血時(shí)使用 edta,檸檬酸鹽或肝素進(jìn)行抗凝。經(jīng)過抗凝處理的血液樣本可以直接用于 dna 純化,需要注意的是使用的 dna 純化方法需要能夠去除上述抗凝劑,以免干擾下游 pcr 檢測(cè)。全血也可以在 dna 純化前*行白細(xì)胞富集等再進(jìn)行 dna 純化。
        從血液中純化 dna 的產(chǎn)量很大程度上取決于血液中的白細(xì)胞數(shù)量,而白細(xì)胞數(shù)量則和血液的供體情況有很大關(guān)聯(lián)(如貧血或感染都會(huì)造成白細(xì)胞數(shù)量變化)。上述情況必須在進(jìn)行 dna 純化前就應(yīng)該考慮到。此外,有些動(dòng)物有有核血,這意味著這類樣本中含有更多的 dna,在從此類血樣中純化 dna,上樣量需要減少 10 倍左右。
        從細(xì)胞中純化 dna
        哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以使用蛋白酶 k 進(jìn)行裂解酵母細(xì)胞需要先使用*對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行處理,然后使用蛋白酶或蛋白酶 k 進(jìn)行消化許多**細(xì)胞可以使用裂解 buffer 和蛋白酶 / 蛋白酶 k 進(jìn)行裂解,某些**如革蘭氏陽性菌需要預(yù)先使用*對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行處理**細(xì)胞需要先從生物體液中沉淀,然后從中純化** dna,拭子樣本需要先使用**劑進(jìn)行預(yù)處理然后再離心使用機(jī)械裂解會(huì)比用酶消化的效果要好,尤其是針對(duì)革蘭氏陽性菌或**而言
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