本文要點(diǎn)：阿爾茨海默病(ad)是臨床廣泛的神經(jīng)退行性疾病，嚴(yán)重威脅人們的生命健康。β 淀粉樣蛋白 (aβ) 作為ad的典型病理生理學(xué)標(biāo)志物，來源于單體 aβ 自發(fā)聚集成形成不溶性aβ原纖維，積聚并沉積在大腦中，從而誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)性疾病。目前還沒有有效的策略來治療ad的發(fā)生發(fā)展。腦脊液的診斷過程具有侵入性（脊髓穿刺），因此不被廣泛接受。相比之下，開發(fā)用于檢測aβ蛋白的成像探針為ad的早期表征和及時(shí)干預(yù)提供了有效策略，如正電子發(fā)射斷層掃描（pet）、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（spect）和磁共振成像（mri）等。然而這些探針具有靈敏度低、成本高、電離輻射和高背景等缺點(diǎn)，因此開發(fā)可激活熒光探針具有重要意義。近紅外二區(qū)小動物活體成像系統(tǒng) - mars
目前，用于aβ蛋白的成像熒光探針有硫黃素t（tht）和硫黃素s（ths），但他們的發(fā)射波長短（480 nm），血腦屏障（bbb）穿透能力差，限制了它們的體內(nèi)應(yīng)用。此外，雖然有一些可激活的熒光探針用于aβ蛋白的體內(nèi)成像，但這些探針的熒光發(fā)射通常位于nir-i區(qū)(650–900 nm) ，穿透深度淺，信噪比(snr)低，不適合腦組織成像。因此本文作者開發(fā)了nir-ii區(qū)（900–1700 nm）發(fā)射的可激活熒光探針用于aβ蛋白的體內(nèi)成像(圖1)。
圖1. dmp2用于aβ蛋白的體內(nèi)成像
首先，作者設(shè)計(jì)并篩選了一系列aβ蛋白的特異性nir-ii熒光響應(yīng)探針(d-π-a結(jié)構(gòu))，探針由三部分組成：咔唑或二甲氨基苯為電子供體（d），噻吩橋或雙鍵為π橋，同時(shí)提高親脂性（容易透過bbb），以及苯并吲哚鎓作為電子受體（a），合成了熒光探針ecv、dmp1、dmp2和dmp3（圖2a）。隨后，作者評價(jià)了探針的光學(xué)性能。溶劑效應(yīng)測試說明ecv發(fā)射位于nir-i區(qū)，其他三種化合物均處于nir-ii區(qū)（圖2e-h）。gaussian09w計(jì)算進(jìn)一步說明更強(qiáng)的給電子作用能夠增強(qiáng)推拉效應(yīng)，從而產(chǎn)生nir-ii區(qū)的紅移熒光（圖2i）。
圖2. (a) 探針的分子結(jié)構(gòu) (e、f、g、h) ecv、dmp1、dmp2和dmp3探針在不同極性溶劑中的熒光光譜。(i) 探針在水中的homo-lumo能極差。
此外，作者還觀察到這四種探針對粘度有依賴性的熒光變化，所以推斷探針可能發(fā)生了扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過程(twisted intramolecular charge transfer, tict)。tict效應(yīng)已被用于檢測a β蛋白的熒光探針的構(gòu)建，抑制分子內(nèi)的tict效應(yīng)能夠提高熒光探針的穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率。緊接著，作者測試并篩選了探針對aβ原纖維的響應(yīng)情況。與aβ原纖維孵育后，dmp1、dmp2和dmp3的nir-ii熒光分別選擇性的增強(qiáng)了27.0倍、41.8倍和43.1倍，而ecv幾乎無差異（圖3f-h）。熒光增強(qiáng)可能是由于aβ原纖維介導(dǎo)了探針在光照射情況下從非發(fā)射扭曲的tict狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦邿晒鉁?zhǔn)平面局部激發(fā)(le)狀態(tài)。相比于商業(yè)探針tht僅5.1倍的熒光增強(qiáng)，dmp2和dmp3具有更理想的成像對比度?；跓晒獾娘柡徒Y(jié)合法計(jì)算dmp2的結(jié)合親和力(kd)為42.0 nm，與aβ原纖維具有很好的結(jié)合親和力（圖3i-k）。然后作者使用dmp2測試其與tht結(jié)合的aβ原纖維的競爭位移能力，置換率高達(dá)72%(圖3l)。
圖3. (e) 探針與aβ聚集體結(jié)合后的熒光增強(qiáng)倍數(shù) (f、j、h) 探針在其他潛在干擾物存在時(shí)對aβ聚集體的選擇性研究(1-10：潛在干擾物，離子、氨基酸和牛血清白蛋白等11：aβ 單體) (i、j、k) pbs溶液中探針的結(jié)合親和力測定 (l) dmp2和tht探針的競爭置換實(shí)驗(yàn)。
然后，作者使用分子對接軟件模擬了探針與aβ原纖維之間的相互作用(圖4)，進(jìn)一步說明了dmp2探針具有高選擇性的熒光“off-on”響應(yīng)和與aβ蛋白的強(qiáng)結(jié)合親和力，在檢測aβ蛋白方面具有很大前景。
圖4. dmp2與aβ原纖維的相互作用圖
隨后，作者檢測了dmp2與aβ蛋白結(jié)合后nir-ii熒光的穿透深度。nir-ii熒光在0.5 cm厚度下的信噪比仍然為20.4，在1.5 cm的厚度上，nir-ii熒光信號仍是可識別的(圖5a-b)。與此同時(shí)，作者通過構(gòu)建體外血腦屏障模型（圖5c）測試了dmp2穿透血腦屏障的能力。dmp2的通透性隨孵育時(shí)間的增加而增加，120 min后達(dá)到23.8%，比tht高9.9倍，與fda批準(zhǔn)的可穿透血腦屏障的藥物替莫唑胺(tmz)相當(dāng)，說明其其親脂性適合穿透血腦屏障(圖5d)。
圖5. (a、b) dmp2探針在溶液和腦切片中的組織滲透能力研究 (c、d) 體外血腦屏障模型及transwell室滲透性試驗(yàn)
在活體測試中作者選用探針dmp2與商業(yè)探針ths分別對野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因ad模型小鼠的腦組織切片進(jìn)行成像對比，正如預(yù)期的，在dmp2或ths染色后，在野生型小鼠腦切片中沒有觀察到明顯的熒光。相比之下，在用ths和dmp2染色后，來自ad模型小鼠的腦切片在大腦皮層和海馬區(qū)域顯示出聚集性熒光，表明dmp2對aβ蛋白的檢測具有高度特異性。此外，對腦切片中線性靶向區(qū)域熒光強(qiáng)度的定量研究進(jìn)一步說明了dmp2和ths均可染色aβ蛋白，但前者的信號更強(qiáng)（圖5 e-f）。
圖5 (e、f)野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因ad模型小鼠的腦組織切片成像
最后在體內(nèi)成像時(shí)，作者選用8月齡的app/ps1轉(zhuǎn)基因ad模型小鼠和野生型小鼠進(jìn)行研究（圖6a）。野生型小鼠在注射dmp2后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦內(nèi)熒光信號均較弱。而ad模型小鼠僅注射后10分鐘就觀察到了明顯的nir-ii熒光信號，且能在腦內(nèi)長時(shí)間保留，可用于體內(nèi)實(shí)時(shí)縱向成像（圖6b）。隨后作者處死小鼠提取腦組織，記錄nir-ii熒光成像，進(jìn)一步證實(shí)nir-ii熒光來源于ad小鼠腦組織。同時(shí)，共聚焦成像顯示的皮層和海馬部位明顯的熒光信號說明dmp2可以高效高特異性的識別ad模型小鼠的aβ蛋白，可用于aβ蛋白的wu創(chuàng)成像，深入了解疾病的發(fā)生發(fā)展（圖6f）。
圖6 (a) dmp2探針的nir-ii熒光成像示意圖 (b)野生型小鼠和ad模型小鼠的活體腦成像 (f) aβ單克隆抗體(moab)染色后的腦組織切片離體熒光圖像
參考文獻(xiàn)
miao, j., miao, m., jiang, y., zhao, m., li, q., zhang, y., et al. (2023). an activatable nir-ii fluorescent reporter for in vivo imaging of amyloid-beta plaques. angew chem int ed engl, 62(7),e202216351.
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近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - mars
nir-ii in vivo imaging system
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恒光智影
上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評為上海市“科技創(chuàng)新行動計(jì)劃”科學(xué)儀器領(lǐng)域立項(xiàng)單位。
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